敖秋桅 朱佳杰

摘要：【目的】比較吉富羅非魚F5代（以下簡稱吉富F5代）、吉富羅非魚F0代（以下簡稱吉富F0代）及奧尼羅非魚對4種病原菌的抗病力差異，為羅非魚苗種推廣養(yǎng)殖提供參考依據(jù)?！痉椒ā繖z測吉富F5代無乳鏈球菌（Ia和Ib血清型）、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌對吉富F5代的半致死濃度（LC50），并對3個羅非魚種群進(jìn)行人工腹腔注射感染4種病原菌，根據(jù)感染后的累計死亡率評估其抗病力差異?！窘Y(jié)果】無乳鏈球菌Ia血清型對吉富F5代的LC50為2.14×105 CFU/mL，無鏈球菌Ib血清型對吉富F5代的LC50為2.14×106 CFU/mL，海豚鏈球菌對吉富F5代的LC50為2.14×107 CFU/mL，嗜水氣單胞菌對吉富F5代的LC50為5.62×107 CFU/mL。3個羅非魚種群感染病原菌后連續(xù)觀察168 h發(fā)現(xiàn)，感染無乳鏈球菌Ia血清型菌株（HN016）的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代>吉富F5代>奧尼羅非魚;感染無乳鏈球菌Ib血清型菌株（GX26）的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代>吉富F5代>奧尼羅非魚;感染海豚鏈球菌菌株（GX05）的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代>奧尼羅非魚>吉富F5代;感染嗜水氣單胞菌菌株（GX03）的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代>吉富F5代>奧尼羅非魚。方差分析結(jié)果顯示，吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03后的累計死亡率均顯著低于吉富F0代（P<0.05），與奧尼羅非魚差異不顯著（P>0.05）?！窘Y(jié)論】經(jīng)過連續(xù)5代選育后，吉富羅非魚對無乳鏈球菌（Ia和Ib血清型）、海豚鏈球菌及嗜水氣單胞菌的抗感染能力均得到顯著提高，并已接近奧尼羅非魚的抗病水平。

關(guān)鍵詞： 羅非魚;抗病性;無乳鏈球菌;海豚鏈球菌;嗜水氣單胞菌

0 引言

【研究意義】我國自20世紀(jì)90年代后期引進(jìn)吉富羅非魚并大面積推廣養(yǎng)殖后，羅非魚產(chǎn)業(yè)得到飛速發(fā)展，并逐步發(fā)展成為全球最大的羅非魚養(yǎng)殖及出口國家（陳勝軍等，2007;袁永明等，2013）。但近年來，由于養(yǎng)殖模式落后、水體環(huán)境惡化、種質(zhì)退化及大規(guī)模疾病頻發(fā)，養(yǎng)殖戶承受了巨大經(jīng)濟(jì)損失，已嚴(yán)重制約羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展（王世表等，2016）。在羅非魚的眾多疾病中，以細(xì)菌性疾病的危害最嚴(yán)重，代表性病原菌有無乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌等，當(dāng)前尚無有效的防治手段（孫永軍，2014）。此外，養(yǎng)殖戶為預(yù)防疾病暴發(fā)而濫用抗生素，導(dǎo)致商品魚藥物殘留超標(biāo)，水體環(huán)境嚴(yán)重污染，尤其是耐藥菌株的產(chǎn)生導(dǎo)致病害頻繁發(fā)生。已有研究表明，從種質(zhì)上提高羅非魚的天然抗病力以抵御病原菌入侵，是上解決病害防治及食品安全問題最有效的方法（紀(jì)榮興，2008;朱佳杰，2019）。因此，研究羅非魚對不同病原菌的抵抗力，對綜合評價其抗病力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在水產(chǎn)生物抗病育種上，日本科學(xué)家成功獲得虹鱒的抗病品種，并發(fā)掘了相關(guān)抗傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）的QTL標(biāo)記（Ozaki et al.，2001）;挪威科學(xué)家對大西洋鮭進(jìn)行家系育種及分子標(biāo)記輔助抗病育種，建立了一批抗IPNV家系和易感病家系（Storset et al.，2007）。近年來，我國水產(chǎn)育種技術(shù)突飛猛進(jìn)，大量學(xué)者圍繞水產(chǎn)動物的高產(chǎn)、抗逆、抗病等性狀開展品種選育研究工作。陳松林等（2008）通過人工感染牙鲆篩選、構(gòu)建抗病力強(qiáng)家系，同時結(jié)合生長數(shù)據(jù)，獲得了抗鰻弧菌病、生長快的新品種鲆優(yōu)1號;此外，又以養(yǎng)殖群體和渤海野生群體的半滑舌鰨為基礎(chǔ)群，通過家系構(gòu)建和人工感染鰻弧菌方式，篩選獲得了一批抗病力強(qiáng)、生長速度快的家系（陳松林等，2010）?？捉艿龋?012）開展中國對蝦生長和抗病的多性狀復(fù)合選育研究，獲得新品種黃海2號，其生長速度和抗病能力均得到明顯提升。鄭衛(wèi)衛(wèi)（2016）使用家系選育法構(gòu)建一批抗鰻弧菌牙鲆家系，并通過育種值估計，發(fā)現(xiàn)抗病性能在親子代得到較好遺傳。白姍姍等（2017）開展鏡鯉抗鯉皰疹病毒（CyHV-3）新品種選育工作，發(fā)現(xiàn)其F3代的抗病力已得到穩(wěn)定提升。奧尼羅非魚的抗病能力顯著優(yōu)于吉富羅非魚，但存在生長速度偏慢、產(chǎn)苗率低、群體均勻度差等問題，影響?zhàn)B殖推廣;吉富羅非魚因具有生長速度快、產(chǎn)量高等優(yōu)勢已成為目前羅非魚主養(yǎng)品種，但其抗病能力弱，急需改良（莫振明和林東年，2010;朱佳杰等，2015;祝璟琳等，2017）。朱佳杰（2019）自2012年起開展羅非魚抗無乳鏈球菌病新品種選育工作，至今已選育5個世代，并于2018年通過全國水產(chǎn)原良種委員會審定，命名為壯羅1號羅非魚，其養(yǎng)殖成活率比普通吉富羅非魚提高15.2%～21.4%，生長速度較普通吉富羅非魚提高9.1%～15.1%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】羅非魚品種繁多，種質(zhì)資源較豐富，不同品種間的天然抗病力存在差異。在水產(chǎn)品種抗病選育中，通常采用特定單一的病原菌對育種對象進(jìn)行人工感染，從中挑選出耐受力強(qiáng)的個體或家系。而羅非魚病害監(jiān)測結(jié)果顯示，羅非魚病害已從單一病原發(fā)病逐步過渡至多病原發(fā)?。▏伊_非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，2016），但目前關(guān)于羅非魚對多種病原菌的抗病力研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以吉富羅非魚F5代（以下簡稱吉富F5代）、吉富羅非魚F0代（以下簡稱吉富F0代）及奧尼羅非魚為對象，分別采用自然環(huán)境下的常見病原菌無乳鏈球菌（Ia和Ib血清型）、海豚鏈球菌及嗜水氣單胞菌進(jìn)行注射感染，分析3個羅非魚種群對4種病原菌的抗病力差異，為壯羅1號羅非魚的推廣及后續(xù)新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用吉富羅非魚為2003年從國家級青島羅非魚良種場引進(jìn)，2012年以抗無乳鏈球菌病感染能力和生長速度為目標(biāo)進(jìn)行選育，現(xiàn)已選育至F5代（吉富F5代），同時每年采用群體繼代選育方法進(jìn)行保種擴(kuò)繁（吉富F0代）。奧尼羅非魚由國家級廣西南寧羅非魚良種場繁育提供。挑選健康有活力、規(guī)格統(tǒng)一（平均重56.48±0.70 g）的3個種群羅非魚各500尾，試驗(yàn)前用雞血平板分離檢測各種群羅非魚是否攜帶無乳鏈球菌等病原。常規(guī)暫養(yǎng)8～10 d，提供充足氧氣及保持水質(zhì)清新。試驗(yàn)菌株分別為無乳鏈球菌Ia血清型菌株（HN016）、無乳鏈球菌Ib血清型菌株（GX26）、海豚鏈球菌菌株（GX05）和嗜水氣單胞菌菌株（GX03），均由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院魚病室保存提供。

1. 2 半致死濃度（LC50）測定

使用血平板菌落計數(shù)法計算菌液濃度，并以10倍梯度對病原菌懸液進(jìn)行稀釋。各菌株的系列梯度濃度為：5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104和5.0×103 CFU/mL。挑選健康無外傷、規(guī)格統(tǒng)一的吉富F5代200尾，每個梯度濃度菌懸液腹腔注射10尾羅非魚，注射量為0.2 mL/尾，對照組注射等體積無菌生理鹽水，試驗(yàn)組設(shè)2次重復(fù)。每組單獨(dú)飼養(yǎng)在容量為1 m3的大白桶中，保持水溫30～31 ℃。定時觀察魚的發(fā)病和死亡狀況，持續(xù)觀察168 h。LC50參照Reed-Muench法進(jìn)行計算。

1. 3 不同品系羅非魚感染病原菌結(jié)果對比

選取規(guī)格無明顯差異的吉富F5代、吉富F0代和奧尼羅非魚，通過腹腔注射分別感染HN016（1.07×106 CFU/mL）、GX26（1.07×107 CFU/mL）、GX05（1.07×108 CFU/mL）和GX03（2.81×108 CFU/mL），菌株感染濃度根據(jù)上一步試驗(yàn)所得的LC50計算。每30尾為1組，每組設(shè)2次重復(fù)，每尾注射量0.2 mL，總計感染720尾魚。3個羅非魚種群均設(shè)30尾的對照組，注射等體積無菌生理鹽水。注射感染后定時觀察試驗(yàn)魚死亡狀況，持續(xù)觀察168 h，及時清理死魚，保持水質(zhì)良好，水溫控制在30～31 ℃。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計及單因素分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同病原菌的LC50測定結(jié)果

吉富F5代感染不同濃度HN016后，病魚眼睛和鰓蓋充血，魚體失去平衡轉(zhuǎn)圈亂游，解剖后發(fā)現(xiàn)魚體肝胰腺、腎臟和脾臟明顯腫大，腸壁變薄。從圖1可看出，吉富F5代感染不同濃度HN016后12 h開始出現(xiàn)死亡，而相應(yīng)的對照組無死亡現(xiàn)象發(fā)生;感染后24～84 h為死亡高峰期，感染84 h后死亡魚數(shù)逐漸減少，感染168 h后基本停止死亡;大于或等于1.0×106 CFU/mL的3個濃度感染吉富F5代的累計死亡率均超過50.00%。經(jīng)Reed-Muench公式計算得知，HN016對吉富F5代的LC50為2.14×105 CFU/mL。

從圖2可看出，吉富F5代感染不同濃度GX26后36 h開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病狀況與感染HN016相似，相應(yīng)的對照組也未見死亡發(fā)生;感染后48～108 h為死亡高峰期，感染120 h后死亡魚數(shù)逐漸減少;濃度大于或等于1.0×107 CFU/mL的2個濃度感染吉富F5代的累計死亡率均超過50.00%，低濃度（≤1.0×103 CFU/尾）GX26感染未出現(xiàn)死亡。經(jīng)Reed-Muench公式計算得知，GX26對吉富F5代的LC50為2.14×106 CFU/mL。

從圖3可看出，吉富F5代感染不同濃度GX05后24 h開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病狀況與感染HN016相似，相應(yīng)的對照組也未出現(xiàn)死亡;感染后24～72 h為死亡高峰期，感染96 h后死亡魚數(shù)逐漸減少;高濃度（≥1.0×108 CFU/尾）GX05感染吉富F5代的累計死亡率為60.00%，低濃度（≤1.0×103 CFU/尾）GX05感染未出現(xiàn)死亡。經(jīng)Reed-Muench公式計算得知，GX05對吉富F5代的LC50為2.14×107 CFU/mL。

吉富F5代感染不同濃度GX03后，病魚魚體發(fā)黑脫鱗，皮膚潰爛，解剖發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)肝胰腺和腎臟腫大，感染后12 h開始出現(xiàn)死亡，而相應(yīng)的對照組未出現(xiàn)死亡。從圖4可看出，吉富F5代感染GX03后24～60 h為死亡高峰期，感染72 h后死亡魚數(shù)基本穩(wěn)定;高濃度（≥1.0×108 CFU/尾）GX03感染吉富F5代的累計死亡率超過50.00%，低濃度（≤1.0×103 CFU/尾）GX03感染未出現(xiàn)死亡。經(jīng)Reed-Muench公式計算得知，GX03對吉富F5代的LC50為5.62×107 CFU/mL。

2. 2 4種病原菌感染3個羅非魚種群后的死亡率比較

從圖5可看出，3個羅非魚種群注射感染HN016后12 h均開始出現(xiàn)死亡，死亡多集中在感染后96 d內(nèi)，而各相應(yīng)的對照組均未出現(xiàn)死亡。對發(fā)病魚解剖觀察發(fā)現(xiàn)，其病理特征均符合無乳鏈球菌的典型發(fā)病癥狀;對血瓊脂培養(yǎng)基上接種病魚腦組織和肝臟組織的優(yōu)勢菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，也證實(shí)病魚感染的病菌為無乳鏈球菌。感染HN016后168 h，3個羅非魚種群的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代（83.88%）>吉富F5代（50.00%）>奧尼羅非魚（46.67%）。方差分析結(jié)果表明，感染HN016后吉富F5代的累計死亡率顯著低于吉富F0代（P<0.05，下同），總體上略高于奧尼羅非魚，但差異不顯著（P>0.05，下同）。說明吉富F5代抗HN016感染能力已接近奧尼羅非魚的水平。

從圖6可看出，3個羅非魚種群注射感染GX26后36 h開始出現(xiàn)死亡，死亡多集中在感染后120 h內(nèi)。對病魚腦組織進(jìn)行取樣培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢后確定為感染無乳鏈球菌。感染GX26后168 h，3個羅非魚種群的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代（70.00%）>吉富F5代（46.67%）>奧尼羅非魚（43.33%）。方差分析結(jié)果表明，感染GX26后吉富F0代的累計死亡率顯著高于吉富F5代和奧尼羅非魚，但吉富F5代的死亡率與奧尼羅非魚差異不顯著。綜上所述，經(jīng)選育后吉富F5代對無乳鏈球菌（Ia和Ib血清型）的抗感染能力顯著優(yōu)于吉富F0代，已接近奧尼羅非魚的抗病水平。

從圖7可看出，3個羅非魚種群感染GX05后24 h開始出現(xiàn)死亡，死亡多集中在感染后96 h內(nèi)。對病魚腦組織進(jìn)行取樣培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢確定為感染海豚鏈球菌。感染168 h后，3個羅非魚種群的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代（56.67%）>奧尼羅非魚（43.33%）>吉富F5代（40.00%）。方差分析結(jié)果表明，感染GX05后24 h，3個羅非魚種群的死亡率表現(xiàn)為吉富F0代>吉富F5代>奧尼羅非魚，且相互間差異顯著，但感染后168 h，3個種群羅非魚的死亡率表現(xiàn)為吉富F0代>奧尼羅非魚>吉富F5代，吉富F0代的累計死亡率顯著高于奧尼羅非魚和吉富F5代，而奧尼羅非魚和吉富F5代差異不顯著?？梢?，吉富F5代與奧尼羅非魚對海豚鏈球菌的抗感染能力相近。

從圖8可看出，3個羅非魚種群感染GX03后12 h開始出現(xiàn)死亡，死亡多集中在感染后84 h內(nèi)。對病魚腦組織進(jìn)行取樣培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢確定為感染嗜水氣單胞菌。感染GX03后168 h，3個羅非魚種群的累計死亡率排序?yàn)榧籉0代（70.00%）>吉富F5代（50.00%）>奧尼羅非魚（40.00%）。方差分析結(jié)果表明，感染GX03后168 h，吉富F0代的累計死亡率顯著高于吉富F5代和奧尼羅非魚，但吉富F5代的累計死亡率與奧尼羅非魚差異不顯著?？梢姡籉5代抗嗜水氣單胞菌感染的能力與奧尼羅非魚相近。

3 討論

已有研究表明，我國南方羅非魚主產(chǎn)區(qū)的羅非魚病害逐年加劇，主要表現(xiàn)為以細(xì)菌性疾病為主引起大規(guī)模發(fā)病及死亡，其中鏈球菌病發(fā)生最嚴(yán)重，其次是嗜水氣單胞菌（國家羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，2016;蘇友祿等，2019）。吉富羅非魚是我國羅非魚養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種，生長速度快，但抗病力弱，尤其對鏈球菌敏感，極易感染發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，HN016對3個羅非魚種群的毒力最強(qiáng)，GX26次之，GX05和GX03的毒力較弱，而HN016為本課題組前期開展吉富羅非魚抗病選育所選用的毒株，屬于Ia血清型（沈夏霜等，2018）。Ia血清型為羅非魚源無乳鏈球菌的優(yōu)勢血清型，流行范圍廣，時間長，而Ib血清型無乳鏈球菌主要在廣東、廣西及海南小范圍流行（袁偉，2017）。本研究還發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚感染HN016后發(fā)病快，病死率高，而感染GX26后發(fā)病較晚，病死率較低，說明吉富羅非魚對不同血清型菌株的敏感性存在差異。強(qiáng)俊等（2012）采用2.95×10 8 CFU/mL海豚鏈球菌感染吉富和新吉富等羅非魚品系，感染后12 h出現(xiàn)死亡，吉富和新吉富羅非魚累計死亡率分別為36.67%和38.33%，與本研究羅非魚的發(fā)病死亡時間相近，但本研究高濃度（1.0×108 CFU/尾）GX05感染后的死亡率達(dá)60.00%，與強(qiáng)俊等（2012）的研究結(jié)果差異明顯，可能與吉富羅非魚種群的種質(zhì)差異有關(guān)，也可能與致病菌株的毒力相關(guān)。本研究中，吉富羅非魚感染GX03后12 h已有死魚出現(xiàn)，且死亡率急劇上升，說明吉富羅非魚對該菌株非常易感，但感染108 h后死亡魚數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定，發(fā)病魚體表癥呈發(fā)黑脫鱗、解剖后見肝臟腫大壞死，發(fā)病過程及癥狀與柯劍（2011）、楊寧等（2014）研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌感染尼羅羅非魚的癥狀相似，說明本研究開展嗜水氣單胞菌感染吉富羅非魚試驗(yàn)結(jié)果可靠。

在感染死亡率方面，本研究發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚感染HN016和GX26后，其F0代的累計死亡率顯著高于奧尼羅非魚和吉富F5代，吉富F5代的累計死亡率略高于奧尼羅非魚，與柯劍（2011）、Huang等（2013）、祝璟琳等（2017）的研究結(jié)果一致;3個羅非魚種群感染GX05后，吉富F0代的累計死亡率最高，吉富F5代的累計死亡率最低，與強(qiáng)俊等（2012）研究發(fā)現(xiàn)感染海豚鏈球菌后吉富及新吉富羅非魚的累計死亡率顯著高于尼羅羅非魚的研究結(jié)果相似。Huang等（2013）、祝璟琳等（2017）研究表明，奧尼羅非魚由于是尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚遠(yuǎn)緣雜交而得，具有明顯雜種優(yōu)勢，在抗病、抗逆及雄性率等方面均顯著優(yōu)于吉富羅非魚。吉富羅非魚是由不同地理種群的尼羅羅非魚種間雜交選育而成，由于持續(xù)對生長性狀進(jìn)行選擇，其抗病、抗逆等性能已衰減。但本研究發(fā)現(xiàn)，吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03的累計死亡率差異均顯著低于吉富F0代，且與奧尼羅非魚的死亡率相近，說明經(jīng)過5個世代選育后，與調(diào)控羅非魚抗病性狀相關(guān)的優(yōu)勢等位基因得到了很好的富集，其抗病性能已接近奧尼羅非魚的抗病水平，也進(jìn)一步驗(yàn)證了沈夏霜等（2018）對吉富F5代抗病和生長性能的評估結(jié)論。

4 結(jié)論

經(jīng)過連續(xù)5代選育后，吉富羅非魚對無乳鏈球菌（Ia和Ib血清型）、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌的抗感染能力均得到顯著提升，其抗病能力已接近奧尼羅非魚的水平。

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（責(zé)任編輯 思利華）