程 賢， 畢良武*， 曾維星， 趙振東， 陳玉湘， 張笮晦

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210042；2.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院；廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧530200；3.廣西庚源香料有限責任公司，廣西 東興538100)

肉桂(Cinnamomum cassiaPresl)主要分布在我國的廣西，此外，印度、老撾以及越南等地也有種植[1]。 肉桂作為一種常見的中藥材，其主要活性成分為肉桂油[2]。 肉桂油常用于傳統(tǒng)中藥復方，肉桂油深加工產(chǎn)品可用于食品防腐劑、香料、抑菌劑、殺蟲劑和功能性材料等領(lǐng)域[3]。 肉桂油通常由干燥的枝、葉經(jīng)水蒸氣蒸餾所得，具有多種藥理作用。 除此以外，肉桂油提取后的剩余物中含有大量的多酚和黃酮，其中多酚類成分包括兒茶素、原兒茶酸、羥基查爾酮和原花青素等，黃酮類成分包括槲皮素、山柰酚和香豆素等[4-6]。 肉桂中的多酚和黃酮類成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，是天然抗氧化劑的重要來源，具有廣闊的應(yīng)用前景[7-9]。 Prasad 等[10]對肉桂中的總酚類物質(zhì)進行了體內(nèi)和體外的抗腫瘤實驗，結(jié)果表明:肉桂中的總酚類物質(zhì)具有良好的抗腫瘤活性。 Li 等[11]研究表明肉桂中含有黃烷醇等活性多酚類抗氧化物質(zhì)，具有增強胰島素的功能。 鐘益寧等[12]通過測定肉桂多酚對4 種菌的體外抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn):肉桂多酚具有較強的體外抗菌作用。 曾華君等[13]利用細胞分子生物學的手段證明肉桂黃酮成分能有效抑制6-羥基多巴胺誘導的PC12 細胞損傷(帕金森模型)，其作用機制在于肉桂黃酮中含有的多個酚羥基具有較高的還原性，因此能有效抑制細胞膜脂質(zhì)氧化。 林款等[14]對分離得到的肉桂黃酮進行體外抗氧化測試，研究表明:肉桂黃酮顯示出較好的抗氧化效果，效果接近陽性對照Vc。 由此可見，肉桂多酚及黃酮在治療心血管疾病、糖尿病等方面具一定的藥用價值;在開發(fā)食品天然防腐抗菌劑及抗氧化劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 然而，肉桂提取精油后的殘渣并沒有得到充分的利用，對不同部位肉桂蒸油剩余物(CR)化學成分的抗氧化活性比較研究也未見報道。 因此，本研究以桂皮蒸油剩余物(BR)、桂葉蒸油剩余物(LR)、桂枝蒸油剩余物(TR)為原料，經(jīng)過醇提取和大孔樹脂純化處理，測定多酚和黃酮含量，并測定其總抗氧化能力、DPPH·和·OH 的清除能力，旨在深入探索不同部位CR 的抗氧化活性，以期為肉桂資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

干燥的肉桂葉、肉桂枝、肉桂皮，廣西庚源香料有限責任公司，粉碎后過0.25 mm 篩備用。 AB-8 大孔樹脂，購自河北寶恩樹脂科技有限公司;蘆丁(HPLC 純度＞98%)，購自成都德思特生物科技有限公司;沒食子酸(HPLC 純度＞98%)、福林酚試劑，購自上海源葉生物科技有限公司;總抗氧化能力(TAOC)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;無水乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、抗壞血酸(Vc)、1，2-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸鈉、硫酸亞鐵和雙氧水，均為市售分析純。

UV-1800 紫外-可見分光光度計，島津LC-20A 高效液相色譜儀，配有CBM-20A 系統(tǒng)控制器、LC-20AT 泵、SIL-20A 自動進樣器、CTO-20A 柱溫箱、SPD-M20A UV-VIS 檢測器，日本島津公司;LD-UPW-V超純水制備儀;DZF-6020 真空干燥箱。

1.2 肉桂蒸油剩余物活性成分的制備

1.2.1提取取干燥的肉桂葉、肉桂枝和肉桂皮分別粉碎、過篩，轉(zhuǎn)移到水蒸氣蒸餾裝置中，按照料液比1 ∶50(g ∶mL)加入蒸餾水，于100 ℃恒溫水浴加熱3 h，采用抽濾方式分離。 肉桂蒸油剩余物(CR)按照料液比1∶50(g∶mL)進行超聲波乙醇提取30 min，采用抽濾方式分離。 將2 次濾液合并后減壓濃縮至原有體積的1/50，2 ～8 ℃冷藏備用。 取2 mL 真空干燥后得到粗提物，用于含量測定。

1.2.2純化取預(yù)處理好的AB-8 大孔樹脂20 mL，裝入徑高比為1 ∶10 的玻璃層析柱中，加壓使其牢固。 將CR 提取后所得的濃縮液沿壁緩慢加入，上樣量為5 mL，吸附1 h。 以40 mL/h 的流速，用120 mL 水充分洗脫除雜。 依次使用30%、50%和80%的乙醇各120 mL 進行洗脫，合并洗脫液(共計360 mL)，以20 mL 為單位收集，進行黃酮和多酚含量測定以確定合適的洗脫液。 將洗脫液收集，減壓濃縮后真空干燥，得到純化樣品，干燥器內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 活性成分含量測定

1.3.1CR 提取物中總黃酮 按照文獻[15]方法，精密稱取蘆丁對照品5 mg，加入80%乙醇溶液，超聲波溶解，定容，制得1 g/L 的蘆丁對照品溶液。 精密稱取5 mg 純化樣品作為供試品，加入80%乙醇溶液，超聲波溶解，定容，制得1 g/L 的供試品溶液。 精密稱取亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉，分別加入蒸餾水溶解，定容，制得5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和4%氫氧化鈉溶液。

分別準確移取10、50、100、150、200、250 和300 μL 的蘆丁對照品溶液，以80%乙醇補充至0.5 mL。加5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.15 mL，靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液2 mL，加蒸餾水2.2 mL，混勻，靜置3 min。 測定508 nm 吸收波長下的吸光度。 以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。 準確移取250 μL 供試品溶液，同上操作，每種供試品平行制備3份，進行總黃酮含量測定。 取其中一份供試品重復測量6 次考察儀器精密度，同時每隔10 min 測量一次考察樣品穩(wěn)定性。

1.3.2CR 提取物中總多酚 按照文獻[16]方法，精密稱取沒食子酸對照品5 mg，加入蒸餾水，超聲波溶解，定容，制得0.112 g/L 的沒食子酸對照品溶液。 精密稱取5 mg 純化樣品作為供試品，加入蒸餾水，超聲波溶解，定容，制得1 g/L 的供試品溶液。 精密稱取碳酸鈉，加入蒸餾水溶解，定容，制得20%碳酸鈉溶液。

分別準確移取50、100、150、200、250 和300 μL 的沒食子酸對照品溶液，以蒸餾水補充至3 mL，加入福林酚試劑250 μL，靜置5 min，加入20% Na2CO3溶液0.75 mL，混勻，靜置30 min，測定763 nm 吸收波長下的吸光度。 以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。 準確移取250 μL 供試品溶液，同上操作，每種供試品平行制備3 份。 精密度、穩(wěn)定性考察同1.3.1節(jié)操作。

1.3.3HPLC 法同時測定CR 提取物的主要化學成分 分別精密稱取兒茶素、原兒茶酸、香豆素、肉桂酸、肉桂醛和o-甲氧基肉桂醛6 種對照品，用50%甲醇配制成1 g/L 的對照品母液。 6 種對照品各取20 μL，混合均勻，補充280 μL 50%甲醇得到各對照品質(zhì)量濃度為50 mg/L 的混合對照品母液，梯度稀釋至20、10、4、2、1、0.4 和0.2 mg/L，過濾膜以供HPLC 測量分析，以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。 精密稱取純化樣品作為供試品，加入50%甲醇，制得1 g/L 的供試品溶液，過濾膜以供HPLC測量分析。 取其中一份供試品重復測量6 次考察儀器精密度，同時每隔8 h 測量一次考察樣品48 h 內(nèi)穩(wěn)定性。

HPLC 條件:Inertsustain C18柱(4.6 mm ×150 mm，5μm);流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。 洗脫梯度:0 ～2 min 10% B;2 ～10 min 10% ～20% B; 10 ～30 min 20% ～60% B; 30 ～32 min 60% ～10% B;32 ～37 min 10% B。

1.4 抗氧化能力測定

1.4.1總抗氧化能力按照文獻[17]方法，采用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒測定供試品和對照品總抗氧化能力，使用蒸餾水分別配制不同質(zhì)量濃度的純化樣品和抗壞血酸(Vc)溶液，質(zhì)量濃度為10 ～2 000 mg/L，按照T-AOC 測定試劑盒說明書進行操作。 在520 nm 測定樣品吸光度(A1)和空白對照品吸光度(A2)，根據(jù)式(1)計算總抗氧化能力(η總)。

(1)

式中:N—反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總量/取樣量);n—樣品測試前稀釋倍數(shù)。

在37 ℃時，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01 時，為一個總抗氧化能力單位。

1.4.2DPPH·清除能力按照文獻[18]方法，取不同質(zhì)量濃度的供試品和對照品溶液(或蒸餾水)0.5 mL，質(zhì)量濃度10 ～2 000 mg/L，加入0.5 mL DPPH 乙醇(或乙醇)溶液，混勻，室溫放置30 min，以Vc 溶液作為陽性對照，測定517 nm 處的吸光度。 根據(jù)式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中:η—自由基清除率，%;A′1—樣品吸光度;A′2—樣品本底吸光度;A′3—空白吸光度。

1.4.3·OH 清除能力 按照文獻[19]方法，取2 mmol/L 水楊酸鈉/乙醇溶液0.2 mL，加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液(或蒸餾水)0.2 mL，分別加入0.6 mL 不同質(zhì)量濃度的對照品和供試品(或蒸餾水)0.6 mL，最后加入6 mmol/L 雙氧水0.2 mL，37 ℃反應(yīng)1 h，以Vc 溶液作為陽性對照，在510 nm 下測定吸光度。 根據(jù)式(2)計算·OH 清除率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，平行實驗≥3 次，并使用SPSS19.0 軟件進行方差分析和檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮與多酚含量測定的方法學考察

2.1.1黃酮含量測定以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 為顯色劑，采用UV 分光光度計測定樣品中總黃酮的含量。 方法學考察包括線性、精密度和穩(wěn)定性。 以蘆丁為對照品繪制了標準曲線，結(jié)果表明:在質(zhì)量濃度1.28 ～38.34 mg/L 范圍內(nèi)，溶液質(zhì)量濃度與508 nm 處的吸光度的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=9.941 7x-0.007 5，R2=0.991 3。 使用任意一份樣品重復測量6 次，吸光度在0.218 69 ～0.218 96 之間，相對平均偏差(RSD)為0.05%，表明儀器精密度良好。 將同一份樣品每隔10 min 測量一次，考察了樣品50 min 以內(nèi)的穩(wěn)定性，6 次測定的吸光度在0.208 16 ～0.218 72 之間，RSD 值為1.73%，表明顯色反應(yīng)后溶液能在50 min 內(nèi)保持穩(wěn)定。 由此可知，總黃酮含量測定方法的線性、精密度和穩(wěn)定性良好。

2.1.2多酚含量測定以福林酚比色法測定樣品中總多酚的含量，并對多酚含量的測定進行方法學考察。 以沒食子酸為對照品繪制了標準曲線，結(jié)果表明:在質(zhì)量濃度1.40 ～8.40 mg/L 范圍內(nèi)，溶液質(zhì)量濃度與763 nm 處的吸光度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=86.822x+0.012 8，R2=0.999 9。 6 次重復測量的吸光度在0.510 14 ～0.510 61 之間，RSD 值為0.04%。 50 min 溶液穩(wěn)定性測定的吸光度在0.509 84 ～0.515 58 之間，RSD 值為0.44%，表明顯色反應(yīng)后溶液能在50 min 內(nèi)保持穩(wěn)定。 由此可見，總多酚含量測定方法的線性、精密度和穩(wěn)定性良好。

2.2 CR 提取物活性成分的提取、純化及含量測定

2.2.1活性成分的提取與純化肉桂在水蒸氣蒸餾法提取過程中許多非揮發(fā)性的成分會溶解到水中，因此保留了水蒸氣蒸餾提取過程的水提液。 雖然多酚類和黃酮類成分中的黃酮苷極性較大，易溶于水，但是槲皮素、山奈酚等黃酮類以及部分多酚類成分在有機溶劑中的溶解度遠遠超過水溶液。 為了對CR的化學成分提取更加全面，本研究將CR 與水提液分離之后，以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取法對CR 進行二次提取。

將提取液合并、濃縮、真空干燥之后所得樣品中多酚和黃酮含量普遍偏低，兩次提取之后，LR、TR 和BR 粗提物中黃酮質(zhì)量分數(shù)分別為4.31%、15.05%和8.53%;LR 粗提物中多酚質(zhì)量分數(shù)低于定量限，在TR 和BR 粗提取物中多酚質(zhì)量分數(shù)分別為8.24%和7.16%。 由此可見，CR 的不同部位經(jīng)水提和醇提之后，提取物中存在黃酮和多酚類成分，但是含量較低。 已有文獻報道肉桂的主要活性成分為黃酮和多酚，為了提高粗提物中活性成分的含量，選擇AB-8 大孔樹脂對粗提物中的黃酮和多酚進行純化。 為了對活性成分進行特異性洗脫，依次用30%、 50%和80%的乙醇溶液各120 mL 進行洗脫，將不同階段收集到的洗脫液真空干燥之后分別測定多酚和黃酮含量，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖1。 由圖1 可知，30%乙醇溶液對黃酮和多酚類成分幾乎沒有洗脫能力，當乙醇體積分數(shù)提高到80%時，對黃酮和多酚的洗脫能力最強，之后的洗脫液中幾乎沒有黃酮和多酚類成分，因此選用80%的乙醇作為洗脫溶劑。

2.2.2純化前后黃酮和多酚含量變化采用大孔樹脂對提取液充分吸附之后，使用80%的乙醇溶液進行洗脫，洗脫液真空濃縮干燥得到的樣品中黃酮和多酚的含量顯著提高(見表1)。 以LR 為原料，純化之后提取物中黃酮質(zhì)量分數(shù)從4.31%提高到18.50%，多酚質(zhì)量分數(shù)從低于定量限提高到2.60%。 以TR 為原料，黃酮質(zhì)量分數(shù)從15.05%提高到53.94%，多酚質(zhì)量分數(shù)從8.24%提高到37.56%。 以BR 為原料，黃酮質(zhì)量分數(shù)從8.53%提高到44.48%，多酚質(zhì)量分數(shù)從7.16%提高到28.16%。 3 種原料的提取物中黃酮均高于多酚;兩者總含量在3 種原料的提取物差異較大，在TR 和BR 提取物中的質(zhì)量分數(shù)超過50%，分別為91.49%、72.64%，在LR 提取物中的質(zhì)量分數(shù)為21.10%。

圖1 AB-8 樹脂對黃酮和多酚的洗脫曲線Fig. 1 The elution curves of flavonoid and polyphenol by AB-8 resin

表1 肉桂蒸油剩余物的提取物中黃酮和多酚的含量Table 1 The contents of flavonoid and polyphenol extracted from cinnamon distillation residue

2.3 HPLC 測定主要成分

借助HPLC 對CR 提取物的多酚、黃酮和其他主要成分進行了精確的定量分析。 研究對象包括原兒茶酸、兒茶素、香豆素、肉桂酸、肉桂醛和o-甲氧基肉桂醛，這些化合物結(jié)構(gòu)中均含有多個B 環(huán)取代羥基，因此具有一定的還原性[3]。 首先比較了6 種對照品在220 ～380 nm 波長下的色譜圖，為了能夠?qū)χ饕煞衷谕徊ㄩL下檢測，最終選擇在270 nm 波長處進行紫外檢測，HPLC 色譜圖見圖2。 通過比較6 種對照品的出峰時間和提取物中主要色譜峰的出峰時間，確定了CR 提取物中多酚類成分有原兒茶酸和兒茶素，對應(yīng)的出峰時間分別為7.07 和10.23 min，黃酮和其他成分有香豆素、肉桂酸、肉桂醛和o-甲氧基肉桂醛，出峰時間分別為21.03、23.41、25.71 和27.85 min。 這6 種成分為CR 提取物中含量較高的成分，可能是蒸油不充分所致，因此在色譜圖中出現(xiàn)了較強的色譜峰，其他多酚和黃酮類成分如沒食子酸、蘆丁等可能由于含量較低，沒有在色譜圖中明顯出峰。

樣品的HPLC 色譜圖中6 種成分的分離度＞2.0，因此可以實現(xiàn)準確定量。 以峰面積為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制出6 種對照品的標準曲線，結(jié)果見表2。

6 條校正曲線的R2均＞0.999，在相應(yīng)的定量范圍內(nèi)可用于樣品中主要成分的含量計算。 6 種成分重復測量結(jié)果的RSD 值在0.43% ～14.07%之間，均＜15%，表明儀器精密度良好;48 h 內(nèi)6 種成分穩(wěn)定性測定結(jié)果的RSD 值在0.19% ～13.90%之間，均＜15%，表明待測溶液能在48 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。 因此，HPLC 測定方法的線性、精密度和穩(wěn)定性良好，適用于6 種成分的含量測定。

6 個主成分的含量測定結(jié)果見表2。 由表2 可以看出:3 種原料對應(yīng)的提取物中含量最高的成分為香豆素或肉桂酸，屬于黃酮類成分。 6 個主成分在TR、LR 和BR 的提取物中含量差異較大，含量由高到低的順序為TR ＞BR ＞LR，這與顯色法測定提取物中總黃酮和總多酚的結(jié)果一致。

1.原兒茶酸protocatechuic acid;2.兒茶素catechin;3.香豆素coumarin;4.肉桂酸cinnamic acid;5.肉桂醛cinnamic aldehyde;6.o-甲氧基肉桂醛methoxycinnamaldehydea.對照品contral; b.LR; c.TR; d.BR

表2 HPLC 測定主成分含量結(jié)果Table 2 The contents of main compounds measured by HPLC

2.4 抗氧化活性

2.4.1總抗氧化能力3 種原料的提取物及Vc 在不同質(zhì)量濃度時的總抗氧化能力見圖3(a)。 由圖3(a)可見，所有提取物的總抗氧化能力都隨著溶液質(zhì)量濃度的增加而增強，與Vc 趨勢相同。 TR 和BR提取物的總抗氧化能力在質(zhì)量濃度為0.2 g/L 時達到最大，分別為8.2 和8.0 U/mL。 TR 和BR 提取物的總抗氧化能力達到了Vc 的60%以上;LR 的總抗氧化能力相對較差，約為Vc 總抗氧化能力的40%。

2.4.2DPPH·清除能力如圖3(b)所示，隨著提取物和Vc 質(zhì)量濃度的增加，各種物質(zhì)對DPPH·的清除率均表現(xiàn)為先增加后趨于穩(wěn)定。 質(zhì)量濃度低于0.1 g/L 時，Vc、TR 和BR 提取物的DPPH·清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加;而LR 提取物的DPPH·清除能力在質(zhì)量濃度低于0.2 g/L 的范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加。 計算各物質(zhì)的半數(shù)抑制濃度(IC50)值，結(jié)果表明:Vc、TR、BR 和LR 提取物的IC50值分別為0.012、0.017、0.021 和0.150 g/L。 由此可知，TR 和BR 提取物對DPPH·的清除效果較好，清除率略低于Vc，與總抗氧化能力的結(jié)果一致。

2.4.3·OH 清除能力 如圖3(c)所示，當質(zhì)量濃度低于0.05 g/L 時，Vc 的·OH 清除率隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加;當質(zhì)量濃度低于0.2 g/L 時，TR 提取物的·OH 清除率隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，其IC50值為0.12 g/L。 當·OH 清除率趨于穩(wěn)定時，TR 提取物對·OH 的清除率達到Vc 的80%左右，BR和LR 提取物對·OH 的清除能力相對較差，對·OH 的清除率約為Vc 的40% ～50%。

a.總抗氧化能力total antioxidant capability; b.DPPH·; c.·OH圖3 肉桂蒸油剩余物提取物的體外抗氧化性能Fig. 3 Thein vitroantioxidant properties of extracts from cinnamon distillation residue

3 結(jié) 論

3.1利用顯色反應(yīng)分別建立了肉桂蒸油剩余物(CR)提取物中總黃酮和總多酚的含量測定方法，不僅操作簡便快速，而且相對于鹽酸鎂粉法更加安全可靠。 系統(tǒng)的方法學考察結(jié)果表明:線性相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，精密度RSD ＜0.05%，穩(wěn)定性RSD ＜2.00%，適用于總黃酮和總多酚的含量測定。 6 種主成分的HPLC 分析方法線性相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，精密度和穩(wěn)定性RSD ＜15.00%，適用于樣品含量測定。

3.2利用超聲波輔助乙醇提取法對CR 進行二次提取，并與蒸汽蒸餾提取后的水溶液合并，使用AB-8大孔樹脂進行純化，使樣品中黃酮和多酚的含量提高了2.6 ～4.2 倍。 LR、TR、BR 提取物中總黃酮含量均大于總多酚;黃酮和多酚在TR 和BR 提取物中的總質(zhì)量分數(shù)分別為91.49%、72.64%，在LR 提取物中的總質(zhì)量分數(shù)為21.10%;3 種原料對應(yīng)的提取物中含量最高的成分為香豆素或肉桂酸; 6 個主成分在TR、LR 和BR 提取物中含量差異較大，含量由高到低的順序為TR ＞BR ＞LR。

3.33 種原料對應(yīng)提取物的抗氧化能力與樣品質(zhì)量濃度有較強的相關(guān)性。 TR 和BR 提取物的總抗氧化能力在質(zhì)量濃度為0.2 g/L 時達到最大，分別為8.2 和8.0 U/mL;TR、BR 和LR 提取物清除DPPH·的IC50值分別為0.017、0.021 和0.150 g/L，略高于Vc 的0.012 g/L;TR 提取物對·OH 的清除率達到Vc 的80%，而BR 和LR 提取物對·OH 的清除率相對較差，約為Vc 的40% ～50%。