劉立琨 劉得水 李新 岳麗玲 林悅銘 張微 周麗

[摘要] 目的 構(gòu)建pCI2-EDNRB真核表達載體，探討EDNRB過表達對MCF-7細胞增殖的影響。 方法 設(shè)計EDNRB基因特異性引物，應(yīng)用PCR法擴增其編碼序列，構(gòu)建pCI2-EDNRB真核表達載體并轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，RT-PCR和Western blot分別檢測EDNRB的mRNA和蛋白表達;MTT法檢測EDNRB過表達后MCF-7細胞增殖能力。結(jié)果pCI2-EDNRB真核表達載體成功構(gòu)建，MCF-7細胞中EDNRB的mRNA和蛋白水平均較對照組明顯升高，過表達EDNRB抑制了MCF-7細胞的增殖。 結(jié)論 該研究成功構(gòu)建了pCI2-EDNRB真核表達載體，過表達EDNRB可抑制MCF-7細胞增殖，這為深入研究EDNRB在乳腺癌中的功能及分子機制打下良好基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)皮素受體B;真核表達;MCF-7細胞;細胞增殖

[中圖分類號] R736? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2020）01（b）-0026-03

Construction of EDNRB Gene Eukaryotic Expression Vector and Its Effect on Proliferation of MCF-7 Cells

LIU Li-kun1， LIU De-shui1， LI Xin2， YUE Li-ling1， LIN Yue-ming3， ZHANG Wei1， ZHOU Li1

1.Qiqihar Medical Institute of Pharmaceutical Sciences ，Qiqihar， Heilongjiang Province，161006? China; 2.Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College Breast Surgery，Qiqihar， Heilongjiang Province，161000? China; 3.Medical Technology School， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006? China

[Abstract] Objective To construct the eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB and investigate the effect of EDNRB overexpression on the proliferation of MCF-7 cells. Methods EDNRB gene-specific primers were designed and amplified by PCR. The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was constructed and transfected into MCF-7 cells. The mRNA and protein expression of EDNRB were detected by RT-PCR and Western blot， respectively. MTT assay The proliferation ability of MCF-7 cells after over-expression of EDNRB was examined. Results The eukaryotic expression vector of pCI2-EDNRB was successfully constructed. The mRNA and protein levels of EDNRB in MCF-7 cells were significantly higher than those in the control group. Overexpression of EDNRB inhibited the proliferation of MCF-7 cells. Conclusion The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was successfully constructed in this study. Overexpression of EDNRB can inhibit the proliferation of MCF-7 cells， which lays a good foundation for further study of the function and molecular mechanism of EDNRB in breast cancer.

[Key words] Endothelin receptor B; Eukaryotic expression; MCF-7 cells; Cell proliferation

乳腺癌是一種異質(zhì)性很強的惡性腫瘤，不同分子亞型的乳腺癌都有其自身的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、生物學(xué)特點及預(yù)后風(fēng)險。因此，尋找更具潛力的精準的分子靶標對于乳腺癌的治療顯得尤為重要。內(nèi)皮素受體B（endothelin receptor B，EDNRB）是G蛋白偶聯(lián)受體A家族成員，已有研究表明其在多種惡性腫瘤中異常表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-4]。該研究擬構(gòu)建EDNRB真核表達載體，并驗證其對MCF-7細胞增殖的影響，為進一步研究EDNRB在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機制研究打下基礎(chǔ)。

1? 資料與方法

1.1? 材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7購自中科院上海細胞庫;MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;L-15培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;ExTaq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶KpnI、Sal I及T4 DNA連接酶購自Takara公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞購自全式金公司;TRIzol、OPTI-MEM、LipofectaminTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;真核表達載體pCI2由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究室惠贈。

1.2? 方法

1.2.1? 細胞培養(yǎng)MDA-MB-231細胞于含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基、37℃、無CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，MCF-7細胞培養(yǎng)在含10μg/mL胰島素、10%胎牛血清和1%的雙抗（100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素）的MEM培養(yǎng)基中、于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2? pCI2-EDNRB真核表達載體的構(gòu)建從GeneBank中獲取人EDNRB基因序列（NM_000115.4），借助Primer5.0軟件設(shè)計基因特異性引物，上游和下游分別引入Kpn I和Sal I酶切位點。EDNRB上游引物：5'-CGGGGTACCATGCAGCCGCCTCCAAGTCT-3'，下游引物：5'-ACGCGTCGACCTTCTTTCAAGATGAGCTGTATT-3'。TRIzol法提取MDA-MB-231細胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增EDNRB基因全長序列。Kpn I/Sal I內(nèi)切酶對PCI2載體和EDNRB擴增產(chǎn)物雙酶切，純化連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性克隆進行酶切和測序鑒定。

1.2.3? 重組質(zhì)粒pCI2-EDNRB瞬時轉(zhuǎn)染? MCF-7細胞取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，5×105/mL密度接種到6孔板，待細胞匯合度達到80%，按LipofectamineTM 3 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染空載體PCI2作為對照，24 h后提取各組細胞的RNA和蛋白進行mRNA和蛋白水平的鑒定。

1.2.4? RT-PCR檢測 EDNRB mRNA水平的表達TRIzol法提取細胞總RNA進行RT-PCR，β-actin作為參照。EDNRB上游引物：5′-ACAAAGGAAGTT TCTGCGAATC-3′，下游引物：5′- CAGCAGAGGGCAAAGACAAG-3′;β-actin上游引物：5′-CGTGCGTGACATTAGGAGAG 3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTG

GAAGAGTG-3′。反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄30min;95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán);72度延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.5? Western blot檢測 EDNRB蛋白水平的表達重組質(zhì)粒pCI2-EDNRB轉(zhuǎn)染MCF-7細胞24 h后收集各組細胞，RIPA裂解后提取細胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。人兔抗EDNRB一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min后，羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6? MTT檢測細胞增殖將生長良好的MCF-7細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞。細胞融合率達到80%，轉(zhuǎn)染細胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d，每天每組取3個平行孔細胞，加入MTT溶液（20 μL/孔），37℃孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，于490 nm處檢測每孔吸光值，以時間為橫坐標，OD490 nm值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.3? 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析， 計量資料用（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數(shù)資料用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 成功構(gòu)建pCI2-EDNRB重組質(zhì)粒

以MDA-MB-231細胞的cDNA為模板，PCR擴增EDNRB基因的編碼區(qū)，結(jié)果顯示在大約1 300 bp處有特異性擴增條帶，片段大小與預(yù)期產(chǎn)物（1 329 bp）大小相符（圖1A）。將重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，獲得長約4 000 bp和1 300 bp的兩條片段，符合預(yù)期結(jié)果。將陽性克隆進行測序，經(jīng)NCBI BLAST比對，顯示序列完全正確，說明pCI2-EDNRB表達載體成功構(gòu)建（圖1B）。

A. PCR擴增產(chǎn)物，M：DL2 000 DNA marker;1：EDNRB基因PCR產(chǎn)物。B. pCI2-EDNRB重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，M：DL10 000 DNA marker;1：pCI2質(zhì)粒;2：pCI2-EDNRB重組質(zhì)粒;3：pCI2-EDNRB雙酶切產(chǎn)物。

2.2? pCI2-EDNRB轉(zhuǎn)染MCF-7細胞EDNRB的mRNA和蛋白水平上調(diào)

為了驗證EDNRB能否在MCF-7細胞中正確轉(zhuǎn)錄，半定量RT-PCR檢測EDNRB的mRNA表達。結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組中EDNRB的mRNA表達明顯上調(diào)（圖2A）。為了驗證EDNRB能否在MCF-7細胞中正確翻譯，以GAPDH為內(nèi)參進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，對照組EDNRB蛋白表達較弱，相對灰度值為0.195;而pCI2-EDNRB轉(zhuǎn)染組中EDNRB蛋白表達明顯增強，相對灰度值為0.810，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

A. RT-PCR檢測EDNRB的mRNA表達，β-actin作為對照，M：DL2000 DNA marker;1：對照組;2：實驗組。B. Western blot檢測EDNRB的蛋白表達，GAPDH作為對照，1：對照組;2：實驗組

2.3? EDNRB過表達抑制了MCF-7細胞增殖

用Lipofectamine 300 0介導(dǎo)pCI2-EDNRB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48和72 h加入MTT檢測。如圖3所示，與對照組相比，pCI2-EDNRB轉(zhuǎn)染可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，且隨著時間延長，其抑制作用增強。

3? 討論

乳腺癌是一種來源于上皮細胞的惡性腫瘤[5]，其組織細胞具有高度異質(zhì)性[6]，部分腫瘤容易發(fā)生耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，目前在女性癌癥相關(guān)死亡率高發(fā)位居第2位[7]。根據(jù)2015年St. Gallen會議提出的臨床病理替代分子分型，將乳腺癌分為管腔A型（Luminal A type）、管腔B型（Luminal B type）、HER2過表達型（HER2-enriched type）及三陰性乳腺癌（Basal-like or triple-negative breast cancer，TNBC）等4種分子亞型[8]。后兩種亞型預(yù)后較差，尤其是TNBC，預(yù)后最差。因此，對于不同分型和組織學(xué)分級的乳腺癌診治及預(yù)后仍需要精準的分子靶標。

越來越多的研究指出EDNRB在許多人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展進程。Zhou等[1]發(fā)現(xiàn)EDNRB在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞系中的表達較對照組明顯下調(diào)。吳川清等[2]發(fā)現(xiàn)EDNRB在胃癌SGC-7901細胞中因高甲基化而表達缺失，5-Aza-CdR誘導(dǎo)EDNRB重新表達后抑制了SGC-7901細胞的增殖。牟童等[3]發(fā)現(xiàn)EDNRB在肝癌組織和SMMC-7721、Huh7細胞中表達均低于對照組，EDNRB過表達抑制了SMMC-7721和Huh7細胞的侵襲和遷移。劉立琨等[4]發(fā)現(xiàn)EDNRB在乳腺癌MCF-7和ZR-75-1細胞中因啟動子區(qū)CpG島高甲基化而表達缺失。這些結(jié)果均提示，EDNRB異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展進程密切相關(guān)，其有望成為癌癥診治與預(yù)后的新靶點分子，但其如何調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展進程尚未見文獻報道。

綜上所述，該研究選取乳腺癌細胞作為實驗?zāi)Ｐ?，通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建了真核表達載體pCI2-EDNRB，經(jīng)酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，RT-PCR和Western blot結(jié)果證實EDNRB的mRNA和蛋白表達均較對照組高表達，進一步的功能研究顯示過表達EDNRB的MCF-7細胞的增殖能力明顯受到抑制。因此，該文推測EDNRB在乳腺癌中具有抑癌作用。這為進一步研究EDNRB在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制提供理論支持。

[參考文獻]

[1]? Zhou L， Feng X， Shan W， et al. Epigenetic and genetic alterations of EDNRB gene in nasopharyngeal carcinoma[J].Oncology， 2007，72（5-6）：357-363.

[2]? 吳川清， 韓高雄， 帥曉明， 等. 5-氮雜-2-脫氧胞苷對人胃癌SGC-7901細胞株生長及EDNRB基因啟動子異常甲基化的影響[J].世界華人消化雜志， 2010，18（36）：3843-3847.

[3]? 牟童.肝細胞癌中關(guān)鍵基因與microRNA的交互作用分析及EDNRB基因?qū)Ω伟┘毎淖饔醚芯縖D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2017.

[4]? 劉立琨，朱文斌，劉得水，等.4株乳腺癌細胞中內(nèi)皮素受體B基因的甲基化狀態(tài)及對MCF-7細胞增殖的影響 [J].解剖學(xué)報，2018，49（5）： 611-616.

[5]? 陳琛，謝長寬，馮江濤.乳腺癌腫瘤標志物在分子診斷中的作用 [J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（68）：109-110.

[6]? Oltmann J， Heselmeyer-haddad K， Hernandez LS， et al. Aneuploidy， TP53 mutation， and amplification of MYC correlate with increased intratumor heterogeneity and poor prognosis of breast cancer patients[J].Gene Chromosome Canc， 2018， 57（4）：165-175.

[7]? Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2017[J]. CA-cancer J Clin， 2017，67（1）：7-30.

[8]? 邵志敏， 李俊杰. 2015年St.Gallen國際乳腺癌研討會乳腺癌新的診療理念[J]. 中華乳腺病雜志：電子版，2015，9（2）：73-77.

（收稿日期：2019-10-22）

[基金項目] 黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（2016-KYYWF-0863）

[作者簡介] 劉立琨（1982-），女，黑龍江雙城人，博士，助理研究員，研究方向：腫瘤發(fā)生分子機制。