史默怡 韓宇博 劉莉

益氣溫陽活血利水方為筆者團(tuán)隊治療慢性心衰的經(jīng)驗用方，此方法在改善患者中醫(yī)癥候、心臟功能、臨床癥狀方面具有很好療效[1]。前期研究已經(jīng)證明此方可以改善去甲腎上腺素致H9c2心肌細(xì)胞損傷和阿霉素致大鼠心衰模型心肌能量代謝[2-3]，為進(jìn)一步探究機理，在前期基礎(chǔ)上，本課題選用大鼠H9c2心肌細(xì)胞為實驗對象，觀察益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡以及對線粒體凋亡途徑相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)影響，為該藥的臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動物

H9c2大鼠心肌細(xì)胞來源于上海中科院細(xì)胞庫；雄性SD大鼠45只，體重(200±20)g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(黑)2015006，普通飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境2周后進(jìn)入實驗狀態(tài)。

1.2 實驗藥物

益氣溫陽活血利水方：白人參20 g、黃芪20 g、桂枝10 g、丹參15 g、白術(shù)15 g、茯苓20 g、葶藶子15 g、益母草15 g、淫羊藿20 g、仙鶴草30 g、甘草10 g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡(上海麥尚科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；高速低溫離心機(德國Sartorius公司)；-80℃超低溫冰箱(中國海爾)；96孔板(美國Bio-Rad公司)?？ㄍ衅绽煞?1 g)(SIGMA，產(chǎn)地美國，分子量：217)。

1.4 主要試劑

Real-time PCR試劑盒(上海 Novland Co.Ltd )；血管緊張素II干粉(5 mg，SIGMA，產(chǎn)地美國，分子量：1046)1 mg溶解于10 mL PBS制成濃度為1×10-4mol/L的儲存液，使用時1：100稀釋，造模濃度為1×10-6mol/L，微孔濾膜濾過，分裝，避光-20℃保存?？ㄍ衅绽煞?1 g，SIGMA，產(chǎn)地美國，分子量：217)0.217 mg溶于10 mL PBS溶液，使用時1：10稀釋，有效濃度為1×10-5mol/L，微孔濾膜濾過，分裝，避光-20℃保存。

1.5 中藥湯劑制備

方劑中所有中藥在蒸餾水浸泡2小時，操作時白人參切片，葶藶子包煎，煎煮2次，每次煮沸后再煎煮30分鐘，紗布濾過，兩次藥液合并，水浴濃縮成每毫升含6 g生藥的藥液。

1.6 含藥血清制備

45只SD大鼠用隨機數(shù)字方法分為空白對照組15只，中藥方組30只，灌胃前禁食12小時，空白對照組每日灌服與中藥方組等體積生理鹽水，中藥方組每日灌服34.2 g生藥(5.7 mL/200 g大鼠，劑量按70 kg人與200 g大鼠體表面積等效劑量的10倍灌胃)，每日2次，連續(xù)給藥3天，于末次灌胃1～2小時內(nèi)無菌條件下眼動脈采血，3000 r/min離心15分鐘分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56℃滅活30分鐘，分裝標(biāo)示后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將接種好的培養(yǎng)瓶瓶口旋松置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)情況每1～2天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞鏡下觀察約至瓶底80%以上時傳代。傳代時用PBS清洗加入1 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)瓶長軸輕輕搖晃使之覆蓋全細(xì)胞表面，約1分鐘時間，當(dāng)肉眼觀察瓶體內(nèi)液體出現(xiàn)流沙樣改變或顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞脫落瓶底時立即加入1 mL完全培養(yǎng)液，終止消化，用吸管吹打，使細(xì)胞從瓶壁脫落，并且形成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5分鐘，棄上清。用1 mL培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，細(xì)胞計數(shù)。

1.8 細(xì)胞分組及給藥方法

實驗分為6組。含藥血清預(yù)處理4小時后加入AngII，使最終AngII濃度為1×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72小時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型。空白血清對照組：DMEM+8%空白血清；模型組：DMEM+8%空白血清+ AngⅡ；含藥血清高劑量組：DMEM+8%含藥血清+AngⅡ；含藥血清中劑量組：DMEM+4%含藥血清+4%空白血清+AngⅡ；含藥血清低劑量組：DMEM+2%含藥血清+2%空白血清+AngⅡ；卡托普利組：DMEM+8%空白血清+卡托普利(1×10-5mol/L)+ AngⅡ。

1.9 MTT法檢測H9c2心肌細(xì)胞增殖活性

收集處于對數(shù)生長期細(xì)胞狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞，胰酶消化，離心，重懸，細(xì)胞計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，以每孔5×103個細(xì)胞數(shù)目接種于96板孔中，每孔培養(yǎng)基液體為100 μL，置于培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長至平底約80%時，棄去液體，加入不含血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時，使細(xì)胞處于饑餓。含藥血清干預(yù)，細(xì)胞分為6組，每組5個復(fù)孔，藥物提前預(yù)處理4小時后加入AngII，使最終AngII濃度為1×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后每實驗孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4小時。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，避光，振蕩搖勻10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫儀器上測OD(opticol density，OD)值，每組重復(fù)3次，記錄結(jié)果，計算細(xì)胞增殖率，增殖率(%)=實驗組OD值/正常組OD值×100%。

1.10 羅丹明123測H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位

離心后的細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，加入Rho123熒光染液0.5 μg/mL，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，PBS洗滌細(xì)胞2次，重新重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60分鐘。取100 μL細(xì)胞混合液涂于載玻片上，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)濾光片波長488 nm，阻斷濾光片波長515 nm，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.11 免疫組化檢測H9c2細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)

細(xì)胞造模，細(xì)胞爬片采用10%福爾馬林固定20分鐘，PBS沖洗2次，每次2分鐘；SABC染色法進(jìn)行細(xì)胞染色，每組細(xì)胞爬片滴加3%H202，室溫下10分鐘，PBS洗滌3次。滴加5%BSA封閉液，室溫下孵育30分鐘。滴加一抗4℃下過夜，滴加二抗，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3次，每次2分鐘，甩干，DAB溶液顯色，鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，沖洗，酒精梯度干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。Motic 3000顯微攝影系統(tǒng)攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度，在400倍視野拍攝分析，每組每次實驗隨機3次。

1.12 qRT-PCR法檢測H9c2細(xì)胞Caspase-9 mRNA表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)同前，細(xì)胞收集后，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，檢測RNA的濃度和產(chǎn)量以及RNA的完整性。按 “Reverse Transcription Reaction System”試劑盒說明書完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，將設(shè)計的引物序列與cDNA結(jié)合做RT-PCR，反應(yīng)條件：Real-time PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定：95℃ 3分鐘，95℃ 30秒，62℃ 40秒，共40個循環(huán)。見表1。

表1 基因引物序列

1.13 Western Blot法檢測H9c2細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)

收集H9c2心肌細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，配膠完成SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，濃縮膠80 V，30分鐘，待溴酚藍(lán)指示劑移至凝膠底部時調(diào)到100 V，電泳結(jié)束后，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，膜側(cè)為正極，膠側(cè)為負(fù)極，250 mA，2小時，取膜，麗春紅染液進(jìn)行染色，脫脂牛奶封閉液，過夜，一抗、二抗孵育，顯影、定影。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測H9c2心肌細(xì)胞增殖活性

為了研究益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響，從前期實驗中選取3個含藥血清濃度(8%、4%、2%)，并以卡托普利組作為陽性對照組，AngII造模時間為72小時，測OD值，并算出各實驗組細(xì)胞增值率。結(jié)果顯示：模型組與空白組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，增值率明顯降低。含藥血清高、中、低組OD值、增值率與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨濃度的升高其增值率增高，具有劑量依賴性，含藥血清高劑量組增值率最高。含藥血清高劑量組與陽性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，含藥血清高劑量組增值率略低于卡托普利對照組。如表2。

2.2 Rho123觀察H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位

如圖1所示：空白含藥血清組細(xì)胞熒光最強，呈明亮的熒光綠色；模型組細(xì)胞熒光強度明顯減弱，呈暗色調(diào)的熒光綠色。通過益氣溫陽活血利水方含藥血清預(yù)處理后線粒體膜電位明顯改善，高劑量組熒光與模型組比較熒光強度明顯增強，中劑量組較高劑量組差之，低劑量組僅稍有改善?？ㄍ衅绽M與含藥血清高劑量組無明顯差別。

表2 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.3 免疫組化檢測H9c2細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)

免疫組化結(jié)果示如圖2示：空白對照組Bcl-2、Bax蛋白未見明顯表達(dá)，呈弱陽性顯色。與空白對照組比較，AngII模型組Bcl-2蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著增強(P<0.05)。與模型組比較，含藥血清組可見Bcl-2蛋白表達(dá)增高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，呈正相關(guān)劑量依賴性趨勢，以高劑量組調(diào)節(jié)作用最為明顯。與陽性對照組比較，含藥血清高劑量組上調(diào)Bcl-2效果優(yōu)于卡托普利(P<0.05)，下調(diào)Bax效果遜于卡托普利(P<0.05)。見表3。

表3 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞Bcl-2、Bax免疫活性的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.4 Real Time-PCR法檢測H9c2細(xì)胞Caspase-9的mRNA表達(dá)

正常情況Caspase-9的mRNA以一定量低表達(dá)，AngII處理72小時后表達(dá)含量明顯升高，含藥血清預(yù)處理組可以拮抗AngII導(dǎo)致兩者的升高表達(dá)，以含藥血清高劑量組拮抗效果最好?？ㄍ衅绽M下調(diào)作用優(yōu)于含藥血清高劑量組。見表4。

注：A 空白對照組；B 模型組；C 含藥血清高劑量組；D 含藥血清中劑量組；E 含藥血清低劑量組；F 卡托普利組

圖1 益氣溫陽活血利水方含藥血清作用后H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光強度變化(72小時，×400)

注：A 空白對照組；B 模型組；C 含藥血清高劑量組；D 含藥血清中劑量組；E 含藥血清低劑量組；F 卡托普利組

圖2 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞Bcl-2、Bax免疫活性的影響(72小時，×400)

表4 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9mRNA相對表達(dá)含量

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.5 Western Blot法檢測H9c2細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)

AngII能夠促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞的Caspase-9蛋白的表達(dá)，蛋白相對表達(dá)量與空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同濃度的益氣溫陽活血利水方含藥血清預(yù)處理后，可降低Caspase-9蛋白的表達(dá)含量，具有劑量依賴性，各含藥血清組蛋白相對表達(dá)量與AngII模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，卡托普利組結(jié)果優(yōu)于含藥血清高劑量組，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5和圖3。

表5 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

注：1空白對照組；2模型組；3含藥血清高劑量組；4含藥血清中劑量組；5含藥血清低劑量組；6卡托普利組。

圖3 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)影響印跡圖

3 討論

在心血管疾病終末期階段，細(xì)胞凋亡是重要病理機制。細(xì)胞凋亡使心肌細(xì)胞數(shù)量絕對值減少，最終導(dǎo)致心肌收縮功能降低[4]。神經(jīng)體液過度激活參與到了細(xì)胞凋亡的病理機制。Chen BC等[5]研究也證實AngII引起大鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體凋亡途徑是參與凋亡的重要機制，Bcl-2、Bax、Caspase-9是重要的分子機制。Bcl-2和Bax的表達(dá)含量決定細(xì)胞的命運，Bax表達(dá)占優(yōu)勢時，形成Bax同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢時，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，通過兩者間的平衡調(diào)控細(xì)胞存亡[6]。定位在外膜的Bcl-2形成陽離子通道，使質(zhì)子能從線粒體轉(zhuǎn)運到胞漿，避免膜間隙酸化而抑制Cyt-C的釋放，抑制凋亡；Bax通過與陰離子通道或直接使基質(zhì)腫脹而誘發(fā)線粒體膜電位的改變，促進(jìn)Cyt-C釋放而促進(jìn)凋亡。Bcl-2家族亦可與Caspase直接結(jié)合調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，形成Bcl-2-Apaf-1-Caspase復(fù)合物，抑制Caspase-9、Caspase-3的激活，但這種方式不影響Cyt-c和Apaf-1對Caspase-9的激活[7-8]。綜上，本課題選擇Bcl-2、Bax及Caspase-9線粒體凋亡過程的關(guān)鍵指標(biāo)，來反應(yīng)益氣溫陽活血利水方含藥血清對線粒體凋亡途徑的影響。

益氣溫陽活血利水方全方補而不助邪，瀉而不傷正，用藥精當(dāng)，組方嚴(yán)謹(jǐn)，調(diào)補陰陽，溫補臟腑，重在溫補心腎，藥物組合即入“氣分”，也入“血分”。方中人參、黃芪為君藥，人參為群草之冠，大補元氣、滋補強壯；黃芪能夠固表驅(qū)邪，實腠理、強衛(wèi)氣，且有利水之功。桂枝溫通心陽，化氣助陽，平?jīng)_降逆；丹參活血化瘀，茯苓、白術(shù)健脾利濕，固中州助運化，共為臣藥。益母草活血化瘀利水；葶藶子瀉肺平喘利水，且與黃芪配伍，一升一降；仙鶴草補虛消積；淫羊藿溫腎助陽共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥。以上諸藥共奏益氣溫陽、活血利水之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)人參的主要有效成分人參皂苷，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能，促進(jìn)下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，提高機體應(yīng)激能力，同時可增加心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，增強心肌細(xì)胞收縮力[9-10]；黃芪有利尿、抗衰老、增強應(yīng)激和機體免疫力、抗菌的作用，同時擴張冠狀動脈，抑制心肌細(xì)胞凋亡[11-12]。桂枝能擴血管，改善血液循環(huán)，抗凝、抗纖維蛋白酶，且同時具有利尿作用。關(guān)于作用，《本草綱目》記載黃芪配桂枝：“黃芪補三焦，實衛(wèi)氣，與桂同功，特比桂甘平，不辛熱為異耳，但桂則通血脈，能破血而實力氣，芪則益氣也?！?/p>

本實驗研究通過前期預(yù)實驗總結(jié)，選用1×10-6mol/L AngII 72小時成功誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，AngII作用H9c2心肌細(xì)胞72小時后，MTT結(jié)果示，與正常對照組相比，AngII可顯著降低心肌細(xì)胞活性，益氣溫陽活血利水方含藥血清可以顯著拮抗AngII致使的細(xì)胞損傷，且這種拮抗作用具有正相關(guān)劑量依賴性，其中以含藥血清高劑量組(8%)效果最為顯著。本研究用qRT-PCR、Western Blot及免疫組化實驗方法檢測了線粒體凋亡途徑相關(guān)Bcl-2、Bax及Caspase-9的表達(dá)水平，結(jié)果示與空白對照組相比，模型組AngII損傷細(xì)胞后，Caspase-9的表達(dá)水平升高，Bcl-2/Bax的比例降低，AngII通過調(diào)節(jié)上述線粒體凋亡途徑相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)而促使H9c2心肌細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與Raul Vivar課題組用AngII誘導(dǎo)新生幼鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡以及線粒體凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的改變結(jié)果一致[13]。益氣溫陽活血利水方含藥血清能顯著降低AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡水平，降低了AngII造模后升高的Caspase-9基因及蛋白和Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)水平，而且這種調(diào)節(jié)方式具有正相關(guān)劑量依賴性，以含藥血清高劑量組的調(diào)節(jié)方式和改善細(xì)胞的凋亡情況最好，最終有力證明益氣溫陽活血利水方含藥血清通過調(diào)節(jié)了線粒體凋亡途徑抑制了細(xì)胞凋亡。

綜上所述，筆者推斷益氣溫陽活血利水方含藥血清通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平而抑制線粒體膜電位下降，抑制細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-9的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。