藥明康德醫(yī)療器械測(cè)試中心 （江蘇 蘇州 215124）

內(nèi)容提要： MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)為常見(jiàn)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，其廣泛地應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外醫(yī)療器械生物相容性檢測(cè)并為ISO10993所推薦。文章就該試驗(yàn)的幾項(xiàng)參數(shù)細(xì)胞代數(shù)、加樣時(shí)間、血清類(lèi)型和陰性對(duì)照毒性范圍等對(duì)該試驗(yàn)的影響進(jìn)行了驗(yàn)證，以說(shuō)明在該中心試驗(yàn)條件下該試驗(yàn)的穩(wěn)定性，同時(shí)為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作提供參考。

醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)是醫(yī)療器械研發(fā)、生產(chǎn)和監(jiān)督管理共同遵守的技術(shù)規(guī)范。隨著醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，醫(yī)療器械的安全檢測(cè)對(duì)產(chǎn)品安全有效和推動(dòng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用與日俱增，如何科學(xué)穩(wěn)定地按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)醫(yī)療器械進(jìn)行檢測(cè)尤為重要。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)療器械安全性檢測(cè)的重要試驗(yàn)，而MTT法尤為廣泛。

本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)暴露于供試品浸提液后的細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)的變化，進(jìn)而獲得其對(duì)細(xì)胞活力的影響。未被代謝的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）呈現(xiàn)黃色，當(dāng)其被活細(xì)胞代謝消耗后變成難溶的藍(lán)紫色甲瓚。用異丙醇溶解甲瓚并測(cè)量吸光度，活細(xì)胞的數(shù)量與顏色強(qiáng)度相關(guān)?；罴?xì)胞數(shù)量的減少使其總體活力減少，這一減少與藍(lán)紫色甲瓚的形成數(shù)量直接相關(guān)，變化大小可以通過(guò)測(cè)量光密度獲得。本研究通過(guò)對(duì)MTT細(xì)胞毒性所涉及到的細(xì)胞代數(shù)，血清類(lèi)型，給藥時(shí)間以及陰性對(duì)照進(jìn)行了確認(rèn)和研究，為企業(yè)供試品生物相容性測(cè)試提供參考。

1.材料與方法

1.1 儀器、耗材與試劑

生物安全柜，高壓蒸汽滅菌鍋，MEM培養(yǎng)基，胎牛血清，小牛血清，酶標(biāo)儀，高密度聚乙烯（HDPE）。

圖1. L-929細(xì)胞（高密度）

1.2 細(xì)胞代數(shù)參數(shù)

L-929小鼠成纖維細(xì)胞為細(xì)胞毒性試驗(yàn)常用細(xì)胞系，為貼壁細(xì)胞，每傳代一次需進(jìn)行消化一次。本試驗(yàn)通過(guò)相差11代的細(xì)胞對(duì)同一供試品進(jìn)行檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，以驗(yàn)證隨著細(xì)胞代數(shù)的增加，該細(xì)胞系的檢測(cè)敏感度有所變化。

細(xì)胞系：L-929，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）；細(xì)胞凍存：將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為約1×106cells/mL；液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存（-196°C）細(xì)胞代數(shù)：P572和P561。細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖1。

1.3 給藥時(shí)間參數(shù)

細(xì)胞接種后需要將細(xì)胞原培養(yǎng)基去除加入供試品浸提液/溶液，細(xì)胞的給藥一般從左向右，而加樣的速率和時(shí)間可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響，因此標(biāo)準(zhǔn)方法將空白對(duì)照加于左右兩側(cè)進(jìn)行質(zhì)控。本試驗(yàn)通過(guò)以不同的速率給藥分別按照大約2、3、5、7、9、11、15和30min給完一個(gè)細(xì)胞板，從而判斷細(xì)胞在原培養(yǎng)基去除之后因給藥速率不同暴露時(shí)間不同而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.4 血清類(lèi)型參數(shù)

胎牛血清取自剖腹產(chǎn)胎牛，小牛血清取自出生24h之內(nèi)的新生牛。兩種血清均可作為細(xì)胞培養(yǎng)基的重要添加成份，冷凍存放，使用前融化添加，而兩者所含抗體、補(bǔ)體成分是存在一定差異的。本試驗(yàn)采用小牛血清和胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)不同的測(cè)試材料進(jìn)行測(cè)試對(duì)比以期發(fā)現(xiàn)其對(duì)MTT細(xì)胞測(cè)試結(jié)果的影響。

1.5 陰性對(duì)照

醫(yī)療器械的MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)需要同時(shí)測(cè)試陰性材料，并且其結(jié)果應(yīng)當(dāng)保持穩(wěn)定的陰性。本中心使用Hatano研究所食品藥品安全中心獲取的高密度聚乙烯材料（HDPE）并對(duì)其進(jìn)行了約4個(gè)月的測(cè)試監(jiān)控從而獲得該陰性材料毒性歷史值供參考。

2.結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞代數(shù)參數(shù)

本設(shè)施通過(guò)浸提實(shí)驗(yàn)室手套并調(diào)整給藥濃度以獲得特定毒性濃度使用代數(shù)P572和P561的L-929細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)表1。

從表格數(shù)據(jù)以及對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)20%試驗(yàn)手套浸提液在P561和P572細(xì)胞上表現(xiàn)出64.53%到76.74%的細(xì)胞活力，15%試驗(yàn)手套浸提液在P561和P562細(xì)胞上表現(xiàn)出85.09%到92.31%的細(xì)胞活力，10%試驗(yàn)手套浸提液在P561和P562細(xì)胞上表現(xiàn)出79.75%到87.18%的細(xì)胞活力，差異范圍為-6.43%～7.22%，無(wú)顯著性差異。細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞毒性對(duì)比見(jiàn)圖2。

2.2 給藥時(shí)間參數(shù)

本試驗(yàn)通過(guò)浸提實(shí)驗(yàn)室手套獲得毒性浸提液，并對(duì)其進(jìn)行稀釋以得到不同程度的細(xì)胞毒性反應(yīng)。根據(jù)給藥時(shí)間快慢，即細(xì)胞暴露時(shí)間不同數(shù)據(jù)總結(jié)見(jiàn)表2。

從數(shù)據(jù)總結(jié)表和曲線(xiàn)圖（見(jiàn)圖3）可以發(fā)現(xiàn)，10%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為87.35%，30min后給藥活力為85.27%。15%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為75.70%，30min后給藥活力為81.09%。20%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為39.51%，30min后給藥活力為55.03%。25%的手套浸提液在2min給藥情況下活力為21.81%，30min后給藥活力為30.13%?？傊?，低中高濃度毒性的供試品浸提液的給藥速度/給藥等待時(shí)間在30min54s內(nèi)無(wú)顯著變化，可見(jiàn)細(xì)胞在空氣中的暴露在0.5h內(nèi)是不會(huì)影響MTT測(cè)試結(jié)果的。

2.3 血清類(lèi)型參數(shù)

本參數(shù)驗(yàn)證使用兩種培養(yǎng)基對(duì)三種材料，non-PVC膜袋，實(shí)驗(yàn)室手套，膠塞進(jìn)行了浸提，浸提液稀釋后按照一定的稀釋比例進(jìn)行MTT測(cè)試，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，對(duì)比柱狀圖見(jiàn)圖4（FBS：胎牛血清；NBS：新生牛血清/小牛血清）。

表1. 不同代數(shù)對(duì)同一給藥制劑的細(xì)胞毒性表現(xiàn)

圖2. 細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞毒性對(duì)比柱狀圖

表2. 不同毒性浸提液在時(shí)間梯度延長(zhǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的細(xì)胞活力總結(jié)表

圖3. 不同毒性浸提液在時(shí)間梯度延長(zhǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的細(xì)胞活力總結(jié)曲線(xiàn)圖

表3.胎牛血清培養(yǎng)基和小牛血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)時(shí)在不同材料上的細(xì)胞活力表現(xiàn)(%)

所選Non-PVC膜袋為陰性結(jié)果，細(xì)胞活力分別為105.5%和96.53%。所選實(shí)驗(yàn)手套為顯著毒性，活力分別為1.96和2.1%，所稀釋梯度毒性無(wú)差異。在兩種血清環(huán)境下未表現(xiàn)出顯著不同。膠塞為中等毒性材料，在此材料上兩種介質(zhì)浸提液表現(xiàn)出了一定的差異性，如Plug1 50%浸提液活力分別為79.46和90.14%，相差約11%，Plug2 100%浸提中活力分別為60.64%和75.67%，相差約15%。并且所有Plug材料的毒性表現(xiàn)小牛血清高于胎牛血清。說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下某些特定材料可能會(huì)表現(xiàn)出活力差異，這一結(jié)論需要進(jìn)一步的測(cè)試證明。

2.4 陰性對(duì)照

MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)的陰性對(duì)照需要保持70%以上，其毒性表現(xiàn)往往受到批次、制備等過(guò)程的影響。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了連續(xù)4個(gè)月的監(jiān)控，結(jié)果見(jiàn)圖5。數(shù)據(jù)表明，絕大部分HDPE的活力范圍在90%～100%，表明該試驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室條件下具有很好的穩(wěn)定性。

圖4. 胎牛血清培養(yǎng)基和小牛血清培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)時(shí)在不同材料上的細(xì)胞活力表現(xiàn)對(duì)比柱狀圖

圖5. MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)的陰性對(duì)照結(jié)果

3.小結(jié)

本研究中數(shù)據(jù)表明，MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)所采用的L-929細(xì)胞代數(shù)差異在11代以?xún)?nèi)不會(huì)引起測(cè)試結(jié)果的不同。原培養(yǎng)基移出后，給藥時(shí)間在30min54s內(nèi)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，因此該給藥時(shí)間控制在0.5h內(nèi)完成不會(huì)對(duì)供試品活力產(chǎn)生影響。由于在培養(yǎng)基浸提介質(zhì)中的胎牛血清和小牛血清在成分上存在一定差異，其在供試品毒性檢測(cè)上略有差異，但非顯著。購(gòu)自Hatano研究所食品藥品安全中心的陰性對(duì)照材料表現(xiàn)出了良好的陰性結(jié)果，并且在本實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)測(cè)試中活力穩(wěn)定。