王 瑩， 劉子微， 朱建津*， 蔣 蓉

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.無(wú)錫三智生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 214155）

高密度飼養(yǎng)的廣泛應(yīng)用，使得家禽在飼養(yǎng)過(guò)程中面臨各種應(yīng)激。適當(dāng)應(yīng)激有利于機(jī)體度過(guò)短期惡劣環(huán)境，但長(zhǎng)期慢性應(yīng)激會(huì)使能量過(guò)度消耗，激素分泌紊亂，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1-3]。機(jī)體應(yīng)激主要表現(xiàn)為以HPA軸（下丘腦-垂體-腎上腺軸）興奮為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，過(guò)度應(yīng)激使內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到威脅，氧化還原失衡，免疫功能紊亂[4-5]。我國(guó)在肉雞飼料中通常添加大豆油和豬油作為脂肪來(lái)源，飼料級(jí)豬油因成本較低成為更多工廠的選擇，但這種豬油通常會(huì)出現(xiàn)一定程度的氧化，攝入之后會(huì)影響肉雞正常的生理功能，造成機(jī)體應(yīng)激[6-8]。脂肪酸鈣是一種新型的脂肪來(lái)源，它可通過(guò)油脂加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物加含鈣化合物制成，常作為過(guò)瘤胃脂肪來(lái)源用于反芻動(dòng)物日糧中[9]。有研究者發(fā)現(xiàn)脂肪酸鈣可以代替部分油脂作為肉雞的能量補(bǔ)充飼料，不影響生產(chǎn)性能指標(biāo)，同時(shí)可降低飼料的生產(chǎn)成本,是較為理想的飼料油脂替代品[10]。但脂肪酸鈣與甘油三酯結(jié)構(gòu)不同，在體內(nèi)的消化過(guò)程也不同，其對(duì)肉雞機(jī)體氧化還原狀態(tài)和免疫功能的影響未見(jiàn)報(bào)道[11]。因此，作者在肉雞基礎(chǔ)日糧中添加脂肪酸鈣，研究其對(duì)應(yīng)激肉雞氧化還原狀態(tài)和免疫功能的影響，為脂肪酸鈣在黃羽肉雞日糧中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豆油為市售食用級(jí)4級(jí)大豆油，PV值3.93，豬油為市售飼料級(jí)豬油，PV值10.62，脂肪酸鈣為大豆油脂肪酸鈣，純度為80%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%，鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1日齡中速三黃肉雞（浙江綠園禽業(yè)有限公司提供），經(jīng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所檢驗(yàn)合格。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

雞CRH （促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素）、雞ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)、雞CORT（皮質(zhì)酮）試劑盒、雞IgG（免疫球蛋白G）試劑盒、雞IgA（免疫球蛋白 A）試劑盒、IL-6（白介素-6）試劑盒、雞 HSP70（熱休克蛋白70）試劑盒：廈門慧嘉生物科技有限公司產(chǎn)品；CAT（過(guò)氧化氫酶）試劑盒，MDA（丙二醛）試劑盒，SOD（超氧化物歧化酶）試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；總蛋白定量（BCA法）試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。指標(biāo)測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

將360羽一日齡中速黃羽肉雞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（Ⅰ組）和應(yīng)激組（Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組）,每組9個(gè)重復(fù)欄,每欄10羽。各組飼料中添加的油脂分別為豆油（Ⅰ組）、豆油（Ⅱ組）、飼料級(jí)豬油（Ⅲ組）、豆油脂肪酸鈣（Ⅳ組）。對(duì)照組為平養(yǎng)模式，按常規(guī)飼養(yǎng)模式控溫，第一周35℃，之后每周降2℃，直至溫度維持在24℃。應(yīng)激模型為高溫高密度籠養(yǎng)應(yīng)激模型，應(yīng)激組每只雞占籠位面積約390 cm2，飼養(yǎng)溫度維持在35℃。兩組都在肉雞進(jìn)舍之前，用福爾馬林和高猛酸鉀對(duì)雞舍進(jìn)行熏蒸消毒，實(shí)驗(yàn)周期63 d，常規(guī)免疫和飼養(yǎng)管理。

實(shí)驗(yàn)飼料配方：根據(jù)三黃雞的營(yíng)養(yǎng)需要配制，飼料配方見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方Table 1 Composition of the basal diet

1.4 試驗(yàn)樣品采集與測(cè)定

63 d實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)抽取9羽黃羽雞，共36羽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)檢測(cè)分析。取靜脈血入采血管中，4℃，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙肟鼓裳苤校?℃，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。取肝臟、空腸、十二指腸加入預(yù)冷的生理鹽水勻漿制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿，離心10 min后取上清液，-80℃保存，用于測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.5 主要試驗(yàn)設(shè)備

綜合Epoch微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5804R：Eppendorf公司產(chǎn)品；R686VLT超低溫冷凍冰箱：美國(guó) INVETRO公司產(chǎn)品；電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療儀器儀表廠產(chǎn)品；Mettle Toledo AB204-N電子天平、Mettler Toledo 320pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司產(chǎn)品；XB70制冰機(jī)：美國(guó)GRANT公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋：精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.6 數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01，采用GraphPad Prism 5.01軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組肉雞血漿 CRH、ACTH、CORT質(zhì)量濃度顯著升高 （P＜0.05），且Ⅲ組肉雞血漿ACTH極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。 在應(yīng)激組中，Ⅲ組肉雞血漿 CRH、ACTH、CORT質(zhì)量濃度顯著高于其他組（P＜0.05），其中血漿CORT質(zhì)量濃度極顯著高于Ⅳ組（P＜0.01）。Ⅳ組肉雞血漿ACTH、CORT含量顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）且接近Ⅰ組。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的樞紐，是應(yīng)激反應(yīng)的核心反應(yīng)軸路[12-13]。當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，HPA軸被激活，機(jī)體血漿CRH、ACTH和CORT升高[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞HPA軸相關(guān)激素質(zhì)量濃度上升，飼料級(jí)豬油加劇肉雞機(jī)體應(yīng)激狀況，而脂肪酸鈣能有效地改善肉雞機(jī)體應(yīng)激狀況，并且部分相關(guān)激素能恢復(fù)至正對(duì)照組的水平。

圖1 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞HPA軸激素的影響Fig.1 Effect of fatty acid calcium on HPA axis hormone in stressed broiler chickens

由圖2可知，應(yīng)激組肉雞血漿、肝臟和空腸HSP70質(zhì)量濃度均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組，其中Ⅱ組和Ⅲ組肉雞肝臟HSP70質(zhì)量濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。應(yīng)激組中，Ⅲ組肝臟與血漿HSP70質(zhì)量濃度顯著高于Ⅱ組和Ⅳ組（P＜0.05），Ⅲ組空腸HSP70質(zhì)量濃度極顯著高于Ⅳ組（P＜0.01）；Ⅳ組肉雞空腸、血漿HSP70質(zhì)量濃度顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）。 熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是生物在多種應(yīng)激源作用下均可產(chǎn)生的一組保護(hù)性蛋白，用于增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損害的耐受程度，抵抗過(guò)度應(yīng)激所造成的組織細(xì)胞損傷[16]。HSP70是HSPs家族中最重要的一員，在應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞中合成最為顯著[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肪酸鈣可抑制機(jī)體HSP70的過(guò)量表達(dá)，緩解過(guò)度應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的負(fù)面影響。

圖2 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞HSP70的影響Fig.2 Effect of fatty acid calcium on HSP70 in stressed broiler chickens

2.2 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞氧化還原狀態(tài)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)激組CAT活力顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組血清CAT活力極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。應(yīng)激組中，Ⅱ組和Ⅳ組血清CAT活力顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），Ⅳ組肝臟CAT活力顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），且十二指腸CAT活力極顯著高于Ⅲ組（P＜0.01）。CAT可以清除生物體內(nèi)的過(guò)氧化氫，抑制體內(nèi)羥基自由基的形成，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力[18]。試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)CAT活力降低，脂肪酸鈣可以提高應(yīng)激肉雞體內(nèi)CAT活力。

圖3 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞CAT活力的影響Fig.3 Effect of fatty acid calcium on CAT activity in stressed broiler chickens

如圖4所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)激組肉雞MDA含量升高，Ⅱ組和Ⅲ組血清MDA含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。應(yīng)激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組肝臟和十二指腸MDA含量顯著降低（P＜0.05），但血清MDA含量差異不顯著。Ⅳ組血清、肝臟和十二指腸MDA含量顯著低于Ⅲ組（P＜0.05），肝臟MDA含量顯著低于Ⅱ組且與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝過(guò)程中形成的小分子產(chǎn)物，其含量常被用作機(jī)體組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度的生物標(biāo)志物，過(guò)量的MDA會(huì)引起膜脂、膜蛋白交聯(lián)，使膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，影響細(xì)胞的各種功能[19-21]。試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度升高，脂肪酸鈣可以改善這種情況的發(fā)生。

圖4 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞MDA含量的影響Fig.4 Effect of fatty acid calcium on MDA content in stressed broiler chickens

如圖5所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)激組肉雞總SOD活力降低，Ⅲ組血清、肝臟、十二指腸總SOD活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。應(yīng)激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組肝臟和十二指腸總SOD活力顯著升高（P＜0.05），但血清總SOD活力差異不顯著。Ⅳ組血清、肝臟和十二指腸總SOD活力顯著高于Ⅲ組 （P＜0.05），肝臟總SOD活力與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。SOD是生物體中的最重要的抗氧化酶之一，它可以催化氧自由基鏈中超氧自由基生成過(guò)氧化氫，是機(jī)體中天然存在的超氧自由基清除因子，SOD活性的高低反映了組織細(xì)胞清除超氧陰離子的能力[19-20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)SOD活性降低，脂肪酸鈣相較飼料級(jí)豬油可以提高應(yīng)激肉雞體內(nèi)SOD活力。

圖5 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞總SOD活力的影響Fig.5 Effect of fatty acid calcium on T-SOD activity in stressed broiler chickens

2.3 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞免疫功能的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，Ⅱ組血漿、空腸IgG含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組血漿IgG含量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組血漿、空腸IgG含量無(wú)顯著性差異。應(yīng)激組中，Ⅱ組空腸IgG含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），Ⅳ組血漿 IgG 含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05）。IgG是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，是機(jī)體發(fā)生體液免疫的“主力軍”，IgG能通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體、中和毒素、增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬功能調(diào)節(jié)免疫功能，在介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性中也發(fā)揮著重要作用[22-23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)IgG含量下降，脂肪酸鈣能提高應(yīng)激肉雞體內(nèi)IgG含量。

圖6 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞IgG的影響Fig.6 Effect of fatty acid calcium on IgG content in stressed broiler chickens

圖7 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞IgA的影響Fig.7 Effect of fatty acid calcium on IgA content in stressed broiler chickens

如圖7所示，與對(duì)照組相比，Ⅱ組血漿IgA、空腸 sIgA含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組空腸 sIgA含量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組血漿IgA、空腸sIgA含量無(wú)顯著性差異。應(yīng)激組中，Ⅳ組血漿IgA含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），空腸sIgA含量極顯著高于Ⅲ組（P＜0.01）。sIgA是腸道粘膜免疫最重要的免疫效應(yīng)分子，含量占黏膜相關(guān)組織產(chǎn)生所有抗體的80%以上，其獨(dú)特的分泌成分能阻礙微生物的黏附，從而發(fā)揮對(duì)粘膜的保護(hù)作用[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)IgA含量下降，飼料級(jí)豬油加劇了IgA含量的降低，脂肪酸鈣能提高應(yīng)激肉雞體內(nèi)IgA含量。

圖8 脂肪酸鈣對(duì)應(yīng)激肉雞IL-6的影響Fig.8 Effect of fatty acid calcium on IL-6 content in stressed broiler chickens

如圖8所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)激組肉雞IL-6含量升高，Ⅲ組血漿IL-6含量極顯著升高 （P＜0.01）。應(yīng)激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組血漿、空腸IL-6含量顯著降低 （P＜0.05），肝臟IL-6含量差異不顯著。Ⅳ組血漿、肝臟IL-6含量顯著低于Ⅲ組 （P＜0.05），空腸IL-6含量極顯著低于Ⅲ組 （P＜0.01）。IL-6是機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及肥大細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一，IL-6可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞電解質(zhì)分泌、改變內(nèi)皮細(xì)胞通透性引起炎癥反應(yīng)[25-27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綜合應(yīng)激使肉雞體內(nèi)IL-6含量上升，脂肪酸鈣能夠緩解應(yīng)激肉雞IL-6的升高。

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)、機(jī)體氧化還原狀態(tài)、免疫功能三者之間有著密切的關(guān)系[28]。免疫功能的變化是應(yīng)激反應(yīng)的主要效應(yīng)之一，免疫反應(yīng)與HPA軸之間具有雙向的交流通路[24]。Tarcic等發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激導(dǎo)致小鼠胸腺退化，CD4+胸腺細(xì)胞亞群減少，胸腺DNA斷裂，且內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素參與了對(duì)胸腺的抑制作用[29]。Regnier等發(fā)現(xiàn)慢性熱應(yīng)激和冷應(yīng)激抑制了禽類體外T淋巴細(xì)胞的增殖[30]。Hangalapura等認(rèn)為應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和血漿CORT的水平取決于應(yīng)激的持續(xù)時(shí)間[31]。嚴(yán)重應(yīng)激使肉雞抗氧化能力下降，活性氧代謝失衡，當(dāng)細(xì)胞積累的活性氧超過(guò)正常生理代謝所需含量時(shí)，活性氧就會(huì)通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄使蛋白質(zhì)表達(dá)異常；從而引起免疫功能的變化[32]。Lin等研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應(yīng)激可誘導(dǎo)5周齡肉雞氧化應(yīng)激，肝臟比心臟更容易發(fā)生氧化應(yīng)激[33]。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激影響免疫器官中抗氧化酶的活性，急性應(yīng)激使雛雞T-AOC活性顯著降低，免疫器官中MDA水平升高，Hsps表達(dá)水平顯著增加[34]。Chi等認(rèn)為應(yīng)激通過(guò)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使ROS含量升高引發(fā)氧化失衡，其共同作用損害雞外周血淋巴細(xì)胞[35]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激導(dǎo)致肉雞HPA軸相關(guān)激素含量上升，體內(nèi)抗氧化能力降低，免疫功能受損等與前人研究結(jié)果一致。

脂肪酸鈣與普通油脂消化吸收方式不同，它在胃中分解為游離脂肪酸，在腸道中部分游離脂肪酸合成為甘油一酯，從而發(fā)揮乳化劑的作用，提高了脂肪的利用率[36]。過(guò)度應(yīng)激會(huì)使脂肪酶活性下降，機(jī)體消化吸收能力降低，代謝紊亂[37]，這時(shí)脂肪酸鈣在消化吸收方式上的不同成為一大優(yōu)勢(shì)，增強(qiáng)了肉雞對(duì)脂肪的消化能力，為機(jī)體提供充足的能量和必需脂肪酸，提高了肉雞的抗應(yīng)激能力。劉艷琴等發(fā)現(xiàn)脂肪酸鈣對(duì)奶牛的熱應(yīng)激有一定的抵抗作用，這種作用與脂肪酸鈣的添加量有關(guān)[38]。本試驗(yàn)中，Ⅳ組采用的是脂肪酸鈣完全替代油脂的飼喂方法，脂肪酸鈣部分代替油脂飼喂肉雞是否會(huì)有更好的結(jié)果還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，集約化養(yǎng)殖使肉雞處于應(yīng)激狀態(tài)，體內(nèi)抗氧化能力降低，免疫功能下降。飼料級(jí)豬油加劇了應(yīng)激的負(fù)面影響，脂肪酸鈣可以改善應(yīng)激肉雞體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，緩解應(yīng)激對(duì)肉雞免疫功能的不利影響，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。