張文將， 易 健， 賈 平， 陳博威， 韓鵬鵬， 徐 睿， 劉柏炎*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南 益陽 413000）

據(jù)中國心腦血管病報(bào)告統(tǒng)計(jì)顯示，心腦血管疾病已經(jīng)占據(jù)中國城鄉(xiāng)居民死亡的首位，近年居高不下且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致各種心腦血管疾病形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)[2]，引起AS形成的具體機(jī)制目前尚不清楚，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為高脂血癥、高血壓和高血糖、抽煙及遺傳因素的是誘發(fā)AS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，隨著科學(xué)研究的逐步深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為炎癥與AS的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，炎癥反應(yīng)幾乎參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程[5]，自從ROSS首先提出炎癥學(xué)說以來，經(jīng)過大量的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，“炎癥學(xué)說”目前已成為導(dǎo)致AS發(fā)生的主流學(xué)說之一。阿托伐他汀是臨床上應(yīng)用于治療AS的常用藥物，但是長期服用所帶來的不良反應(yīng)也限制了其的廣泛應(yīng)用。為此大量的科學(xué)家試圖尋找一種能夠降脂、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物或者藥食同源的食物，以期從根本上抑制AS的發(fā)生發(fā)展。

中國茶文化源遠(yuǎn)流長，茶作為日常飲品，在人們的日常生活中具有舉足輕重的作用?！侗静菔斑z》提出“茶為萬病之藥”的觀點(diǎn)。綠茶富含茶多酚，茶多酚具有降脂、抗氧化、抗炎、改善血管內(nèi)皮、增強(qiáng)一氧化氮產(chǎn)生的功能，從而起到較好的防治AS的作用[6-9]。但是綠茶性寒，并且富含鞣質(zhì)、脾胃虛寒的患者、秋冬寒涼季節(jié)均不宜飲用。黑茶作為一種后發(fā)酵茶，不僅含有茶多酚，并且在長時(shí)間渥堆發(fā)酵的過程中有諸多微生物參與茶葉物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)在這個(gè)發(fā)酵過程中也產(chǎn)生了茶色素等不同于其他茶葉的成分。茶色素具有較好的調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂和顯著的抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基及抗凝、促纖溶作用[10]。茯磚茶屬于安化黑茶中的特色茶葉，在其發(fā)花過程所產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)真菌冠突散囊菌具備一定的自由基清除能力，同時(shí)其分泌的兒茶素衍生物等具備比茶多酚更強(qiáng)的抗氧化能力，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大優(yōu)勢(shì)的微生物[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌液體發(fā)酵物的結(jié)構(gòu)與降脂藥物洛伐他汀相似[14]。課題組前期已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)安化黑茶中的茯磚茶對(duì)于高脂血癥大鼠具有降脂、抗炎的作用，可降低大鼠主動(dòng)脈腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達(dá)水平[15]；抑制高脂血癥大鼠主動(dòng)脈核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor，NF-κB）蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)[16]。 茯磚茶中的成分具有抗炎、抗氧化、降脂和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

載脂蛋白E（APOE）參與血中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）的轉(zhuǎn)運(yùn)與清除，在脂蛋白的代謝中發(fā)揮著重要的作用[17]。載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠完全缺失APOE，導(dǎo)致血漿中的低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein，LDL）、 （very low density lipoprotein，VLDL）、乳糜微粒等物質(zhì)清除能力受損，引起血漿中的膽固醇水平的升高[18]，為此APOE-/-小鼠是目前研究AS最為廣泛的理想動(dòng)物模型，作者采用APOE-/-小鼠復(fù)制AS模型，觀察安化黑茶中的茯磚茶對(duì)于AS干預(yù)的效果，以期為深入研究安化黑茶抗AS的機(jī)制研究提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡APOE-/-雄性小鼠55只，體質(zhì)量（25±5）g，SPF級(jí)，購自于南京大學(xué)生物模式中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（蘇）2015-0001，品系名APOE Cas9-KO，品系編號(hào)T001458，配繁信息為-82bp/wt配B6J，遺傳背景C57BL/6，基因型：（APOE）KO/KO；8 周齡 C57BL/6J野生型雄性小鼠10只，動(dòng)物許可證號(hào) SYXK（湘）2016-0002；本實(shí)驗(yàn)通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查，動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)為20171001，實(shí)驗(yàn)單位許可證編號(hào)SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2 藥物及試劑 天茯茶：湖南省白沙溪茶廠饋贈(zèng)；阿托伐他?。ㄒ?guī)格：10 mg，批號(hào) 110590）：輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品。生理鹽水、多聚甲醛（biosharp）、水合氯醛：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；mouse氧化型低密度脂蛋白 （oxidized low-density lipoprotein，OX-LDL） ELISA Kit、mouse TNF-α ELISA Kit、mouse 白細(xì)胞介素-1β（interleukin1β，IL-1β） ELISA Kit、mouse 高敏感性 C-反應(yīng)蛋白（high-sensitivity CRP，hs-CRP）ELISA Kit、mouse 單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）ELISA Kit試劑盒：武漢基因美生物科技有限公司產(chǎn)品；蘇木素染色液：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；伊紅染色液：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 飼料配方 西方飲食飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0008，型號(hào)：H10141（脂肪 21%，0.15%膽固醇，具體配方：酪蛋白、蛋氨酸、玉米淀粉、麥芽糖糊精、纖維素、玉米油、無水奶油、礦物質(zhì)混合物、碳酸鈣、維生素混合物、膽固醇）。

1.1.4 主要儀器 體式顯微鏡、光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；超低溫冰箱：海爾股份有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀：貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：德國Hermle公司產(chǎn)品；超純水機(jī)：上海摩勒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)：亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司產(chǎn)品；石蠟包埋機(jī)：德國LEICA儀器公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)：德國LEICA儀器公司產(chǎn)品；恒溫干燥箱：福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀：perkinelmer公司產(chǎn)品；電熱蒸汽滅菌器：美國ZEALWAY公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 按照黑茶推薦成人飲用量干茶10 g/d的劑量來換算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需劑量 （以60 kg人的體質(zhì)量和20 g小鼠體質(zhì)量作為參考，查閱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比值表進(jìn)行換算）。將白沙溪天茯茶用茶刀切取適量，帶無菌手套將其掰成小塊狀稱量，用無菌紗布包裹并放入燒杯中，將實(shí)驗(yàn)室所用III級(jí)水加入燒杯中浸泡30 min，隨后將燒杯放石棉網(wǎng)上用實(shí)驗(yàn)電爐進(jìn)行加熱，武火煮沸之后改為文火煎煮30 min左右，將濃縮藥液倒出，黑茶殘?jiān)铀^續(xù)煎熬，將兩次藥液濃縮所需體積，4 000r/min離心15 min后，取上清液無菌紗布過濾后冷卻放入消毒磨口瓶，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。為防止藥液變質(zhì)，每次所濃縮的藥量為1周左右。黑茶高劑量組用藥2.16 g/kg、黑茶中劑量組用藥1.44 g/kg、黑茶低劑量組用藥0.72 g/kg。阿托伐他汀用量為10 mg/kg，每次將20 mg的藥片放入研缽內(nèi)用研杵碾碎，加入生理鹽水溶解灌胃，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 小鼠飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獨(dú)立通氣籠盒（IVC）中，溫度（24±0.5） ℃，相對(duì)濕度（50%～70%），壓差 20 Pa，晝夜光照節(jié)律?？瞻讓?duì)照組予以普通生長飼料（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供）；模型組和藥物組采用西方飲食輻照飼料，飼料低溫保存；為保證小鼠進(jìn)食的相對(duì)一致，每天定量予以飼料供應(yīng)。飲水為III水，墊料更換次數(shù)為一周兩次，在更換墊料的同時(shí)用84消毒浸泡籠具，自來水沖洗晾干備用，每日補(bǔ)充飼料及水。

1.2.3 動(dòng)物分組、造模與給藥 選取8周齡雄性APOE-/-小鼠55只，持續(xù)西方飲食喂養(yǎng)13周，同時(shí)選用8周齡的C57小鼠作為空白對(duì)照予以普通飼料喂養(yǎng)13周[19-21]，13周后隨機(jī)抽取5只行HE染色，確定造模成功后根據(jù)體質(zhì)量分層，然后隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組和安化黑茶高、中、低劑量組。分組后的APOE-/-小鼠繼續(xù)西方飲食喂養(yǎng)8周，同時(shí)每天上午9點(diǎn)左右予以相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃干預(yù)8周。阿托伐他汀組予以10 mg/（kg·d）藥物灌胃給藥、現(xiàn)配現(xiàn)用；黑茶高劑量組用藥2.16 g/（kg·d）、黑茶中劑量組用藥 1.44 g/（kg·d）、黑茶低劑量組用藥 0.72 g/（kg·d）；空白組和模型組予以等劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.4 標(biāo)本收集與處理 各組小鼠于灌胃第8周末禁食不禁水12 h后，依次進(jìn)行以下操作：（1）將小鼠麻醉后摘眼球取血，室溫靜止2小時(shí)后將血液置于無菌EP管中4℃12 000g離心15 min，分離血清，-80℃分裝保存用于血脂和炎癥指標(biāo)的檢測(cè)，血清避免反復(fù)凍融。（2）脫臼處死小鼠，將小鼠胸腹腔剪開，放到冰盒或者冰塊上操作，迅速摘取小鼠肝臟進(jìn)行稱量，生理鹽水清洗后濾紙拭干，切除小鼠同一部位肝臟組織放入多聚甲醛中以備蘇木精-伊紅染色；摘除脾臟，清除脂肪組織后稱重；迅速抽取10 mL冰生理鹽水配1 mL針頭心尖部進(jìn)行心臟灌注，完畢后將小鼠動(dòng)脈組織轉(zhuǎn)移到放有碎冰的培養(yǎng)皿中，體式顯微鏡工作臺(tái)下操作，用眼科剪快速仔細(xì)的剔除動(dòng)脈管壁上的脂肪組織，將心臟連同0.5～1.0 cm的主動(dòng)脈弓部位眼科剪剪下后進(jìn)行沖洗，轉(zhuǎn)移到體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛中，剩余動(dòng)脈放入凍存管中液氮速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃凍存待測(cè)，最后分離腹部脂肪組織進(jìn)行稱質(zhì)量。固定組織后在4℃冰箱內(nèi)過夜，24小時(shí)后常規(guī)脫水、石蠟包埋并連續(xù)切片，切片厚度5 μm制作石蠟切片，HE常規(guī)染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)的變化。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1）血脂四項(xiàng)檢測(cè) 將100UL小鼠血清和雙蒸水1∶1稀釋混勻后送到益陽醫(yī)專附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用貝克曼庫爾特AU680全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2） 血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試樣本前提前30 min打開酶標(biāo)儀進(jìn)行預(yù)熱，用多功能酶標(biāo)儀450nm光波下進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)OD值，參照說明書中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值代入曲線方程中，計(jì)算出樣品的濃度，對(duì)于所得濃度運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來比較多組間均數(shù)，針對(duì)組間兩兩比較齊者的數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD檢測(cè)，P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠主動(dòng)脈瓣膜附近蘇木精-伊紅染色形態(tài)學(xué)圖片F(xiàn)ig.1 Morphological pictures of hematoxylin-eosin staining near mouse aortic valve

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色結(jié)果

圖1為HE染色結(jié)果?？瞻讓?duì)照組（圖A：40X；圖B：100X）：小鼠動(dòng)脈管壁光滑完整，瓣膜及管壁附近無斑塊附著，管腔中空，內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰；模型組（圖 C：40X；圖 D：100X）：小鼠動(dòng)脈管壁內(nèi)膜及瓣膜明顯增厚，管壁附著有大量的斑塊，主要成分為大量的膽固醇結(jié)晶及泡沫細(xì)胞，中膜平滑肌受壓變薄，管腔明顯狹窄；阿托伐他汀組（圖E：40X；圖F：100X）：小鼠動(dòng)脈管壁附著有斑塊，主要成分為膽固醇結(jié)晶及泡沫細(xì)胞，瓣膜無明顯增厚現(xiàn)象，斑塊附近的中膜平滑肌受壓變薄，管腔狹窄程度小于模型組；黑茶高劑量組（圖G：40X；圖H：100X）：小鼠動(dòng)脈管壁有斑塊附著，呈現(xiàn)偏心狀分布，主要成分以泡沫細(xì)胞為主，瓣膜無明顯增厚，管腔面積有所狹窄；黑茶中劑量組（圖I：40X；圖J：100X）：動(dòng)脈管壁周圍的斑塊呈現(xiàn)偏心狀分布，管腔面積有所狹窄，斑塊主要成分以泡沫細(xì)胞為主，瓣膜無明顯增厚；黑茶低劑量組（圖K：40X；圖L：100X）：動(dòng)脈粥樣斑塊附著于主動(dòng)脈管壁一側(cè)，呈現(xiàn)偏心狀分布，管腔面積減少，中膜平滑肌受壓變薄，主要成分為大量的膽固醇結(jié)晶及泡沫細(xì)胞為主。

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量與肝指數(shù)的比較

表1顯示：與模型組相比，空白組、黑茶高、中、低劑量組小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝指數(shù)均降低（P＜0.05）。

表1 小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝指數(shù)的比較（±SD，n=10）Table 1 The weights of body,liver,spleen,abdominal fat and the live index in mice

表1 小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、肝指數(shù)的比較（±SD，n=10）Table 1 The weights of body,liver,spleen,abdominal fat and the live index in mice

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與阿托伐他汀相比，●P＜0.05，下同

組別肝指數(shù)/%體質(zhì)量/g 肝質(zhì)量/g 腹部脂肪質(zhì)量/g空白組0.9 6±0.0 9△●2 4.1±1.0 8△●0.3 8±0.0 5△●3.9 3±0.3 6△模型組2.8 0±1.4 9*3 8.2±6.8 1*2.2 0±0.7 9*●5.7 6±0.9 2*●他汀組3 8.4±5.5 9*1.6 7±0.3 7*△4.3 0±0.4 3△1.4 8±0.1 5*△3 2.7±2.0 1*△●1.9 9±0.3 5△*●4.5 0±0.3 4*△中劑量3 0.8±2.5 6*△●3.1 3±1.2 8*高劑量1.3 0±0.1 5*△●4.3 0±0.3 7△1.3 8±0.4 1*△●3 3.7±2.4 2*△●低劑量1.5 7±0.1 5*2.0 6±0.1 1*△4.5 4±0.4 0*△

2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠血脂比較

表2顯示：與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、 低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein，HDL）的濃度升高（P＜0.05）；與模型組相比，黑茶不同劑量組TG的濃度降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀相比，黑茶高、中劑量組TG的濃度下降、HDL 的濃度升高（P＜0.05）。

表2 小鼠血清中的 TC、TG、HDL、LDL 的比較（±SD，n=10）Table 2 The contents of TC，TG，HDL，LDL in the serum of mice

表2 小鼠血清中的 TC、TG、HDL、LDL 的比較（±SD，n=10）Table 2 The contents of TC，TG，HDL，LDL in the serum of mice

組別T C/(m m o l/L)T G/(m m o l/L)H D L/(m m o l/L)空白組2.7 3 ±0.2 6△●2.2 7±0.2 3△●0.9 7±0.3 3△●模型組5 0.5 ±4.7 5*●4.4 9±0.4 9*0.3 9±0.0 7△●1 2.1±0.5 9*●1 8.4±0.4 6*●他汀組3 5.8±5.1 4*△4.2 1±0.2 1*1 6.3±1.8 7*△1 0.0±1.0 3*△3.3 3±0.2 5*△●高劑量1 2.2±1.3 5*●4 9.5±1.4 4*●1 8.1±0.4 1*●低劑量中劑量3.1 7±0.2 6*△●1 2.3±1.2 8*●1 7.8±0.5 1*●3.9 5±0.2 7*△4 8.1±2.6 7*●4 9.6± 2.3 1*●1 1.3±1.3 7*●L D L/(m m o l/L)1 8.1±0.2 8*●

2.4 血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β的質(zhì)量濃度

表3-7顯示：與空白組相比，模型組小鼠血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β 質(zhì)量濃度升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β 的質(zhì)量濃度下降（P＜0.05）。

表3 小鼠血清中OX-LDL質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 3 The content of OX-LDL in the serum of mice

表3 小鼠血清中OX-LDL質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 3 The content of OX-LDL in the serum of mice

組別O X-L D L 質(zhì)量濃度/（p g/m L）劑量鼠數(shù)/只空白組4 0.7±0.7 6△●2 0 m L/（k g·d）模型組1 0 1 0 2 0 m L/（k g·d）4 3.3±0.5 1*●他汀組1 0 m g/（k g·d）1 0 3 4.9±1.7 6*△高劑量1 0 3 4.2±2.4 7*△中劑量2.1 6 g/（k g·d）3 4.4±2.8 2*△1 0 1 0 1.4 4 g/（k g·d）低劑量0.7 2 g/（k g·d）3 5.9±1.6 6*△

表4 小鼠血清中MCP-1質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 4 The content of MCP-1 in the serum of mice

表4 小鼠血清中MCP-1質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 4 The content of MCP-1 in the serum of mice

組別鼠數(shù)/只劑量M C P-1 質(zhì)量濃度/（p g/m L）空白組1 0 8 4.8±1.0 3△●模型組1 0 2 0 m L/（k g·d）9 1.8±3.2 8*●他汀組1 0 6 3.8±3.7 9*△1 0 m g/（k g·d）高劑量1 0 2 0 m L/（k g·d）7 9.2±4.3 3*●△1 0中劑量1.4 4 g/（k g·d）7 4.6±4.9 7*△●2.1 6 g/（k g·d）低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）7 8.4±3.2 6*△●

表5 小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 5 The content of TNF-α in the serum of mice

表5 小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 5 The content of TNF-α in the serum of mice

組別T N F-α 質(zhì)量濃度/（p g/m L）鼠數(shù)/只空白組1 0 1 6±5.2 7△●2 0 m L/（k g·d）模型組1 0劑量2 0 m L/（k g·d）1 3 4±6.8 4*●他汀組1 0 1 0 m g/（k g·d）9 6.3±6.2 0*△高劑量1 0 2.1 6 g/（k g·d）1 0 7±6.4 1*△●中劑量1 0 1.4 4 g/（k g·d）1 0 5±6.4 2*△●低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）1 0 7±4.9 0*△●

表6 小鼠血清中hs-CRP質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 6 The content of hs-CRP in the serum of mice

表6 小鼠血清中hs-CRP質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 6 The content of hs-CRP in the serum of mice

組別h s-C R P 質(zhì)量濃度/（p g/m L）鼠數(shù)/只劑量空白組1 0 2 0 m L/（k g·d）5 5 3±1 2.4△●模型組1 0 2 0 m L/（k g·d）6 2 4±2 8.7*●1 0他汀組1 0 m g/（k g·d）5 8 7±1 6.8*△高劑量2.1 6 g/（k g·d）1 0 5 0 9±3 3.2*●△中劑量1.4 4 g/（k g·d）1 0 5 3 5±2 5.4△●低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）5 8 7±1 6.2*△

表7 小鼠血清中IL-1β質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 7 The content of IL-1β in the serum of mice

表7 小鼠血清中IL-1β質(zhì)量濃度的比較（±SD，n=10）Table 7 The content of IL-1β in the serum of mice

組別鼠數(shù)/只空白組1 0 2 0 m L/（k g·d）1 0 1 9.2±0.5 3△模型組他汀組I L-1 β 質(zhì)量濃度/（p g/m L）劑量2 0 m L/（k g·d）1 0 1 8.5±0.7△1 0 m g/（k g·d）高劑量組1 0 2.1 6 g/（k g·d）1 8.4±1.2△中劑量1 0 1 8.5±0.8 4△1.4 4 g/（k g·d）1 0低劑量0.7 2 g/（k g·d）2 2.2±1.5 4●1 9.0±0.6 8△

3 討 論

病理學(xué)HE染色結(jié)果顯示，除空白組之外，其他各組均有不同程度的AS，其中以模型組最為嚴(yán)重，模型組主要表現(xiàn)為動(dòng)脈內(nèi)膜及瓣膜明顯增厚，斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶豐富，血管管腔嚴(yán)重狹窄，提示模型制備成功。阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠動(dòng)脈斑塊明顯低于模型組，說明阿托伐他汀和黑茶對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展均有抑制作用。從鏡下觀的成分來看，模型組、阿托伐他汀組、黑茶低劑量組主要成分為膽固醇結(jié)晶和泡沫細(xì)胞為主，而黑茶高、中劑量組主要成分以泡沫細(xì)胞為主。AS按照病理學(xué)分為脂紋脂斑期（泡沫細(xì)胞為主）、纖維斑塊期（纖維帽、脂類成分、泡沫細(xì)胞為主）、粥樣斑塊期（纖維帽、膽固醇結(jié)晶和泡沫細(xì)胞為主）以及繼發(fā)性病變。那么可見模型組、阿托伐他汀組、黑茶低劑量組已經(jīng)發(fā)展為AS的中晚期，而黑茶高、中劑量組小鼠為AS的早期，由此得知安化黑茶高、中劑量用藥治療可以延緩AS的發(fā)生發(fā)展。

過度肥胖引起脂肪組織中的巨噬細(xì)胞比例增多，而且炎癥表型發(fā)生變化，浸潤性增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞與脂肪組織中的脂肪細(xì)胞交互作用，加速了AS的發(fā)展進(jìn)程[22]，為此抑制肥胖可以起到延緩AS發(fā)展的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示安化黑茶不同劑量組小鼠肝臟重量和肝指數(shù)顯著低于模型組及阿托伐他汀組，提示安化黑茶可以起到很好的抑制體質(zhì)量增長和減少腹部脂肪組織合成的效果；還可以減少脂類物質(zhì)在肝臟的沉積。這可能是安化黑茶延緩AS發(fā)展的原因之一。

高脂血癥是引起AS發(fā)生的最主要的危險(xiǎn)因素，從血脂四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果來看，安化黑茶可以有效降低TG含量，但是對(duì)于TC、LDL、HDL方面并沒有明顯的改善，可見安化黑茶在降低TG方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，并且效果優(yōu)于阿托伐他汀。過多的脂類物質(zhì)在動(dòng)脈管壁的長期沉積加速AS的發(fā)生發(fā)展，而黑茶不同劑量組均可以通過抑制TG的合成來延緩AS的發(fā)生發(fā)展，這可能是黑茶延緩AS發(fā)展的原因之一。而阿托伐他汀在降低TG含量上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。為此推薦高脂血癥患者在日常生活中可以適當(dāng)飲用黑茶來抑制甘油三酯的產(chǎn)生。而對(duì)于混合性高脂血癥等癥患者我們建議在服用他汀類藥物降低膽固醇的同時(shí)，可以配合常規(guī)攝入黑茶的方式來降低體內(nèi)的甘油三酯的含量，從而抑制脂類物質(zhì)在動(dòng)脈管壁的沉積來延緩AS的發(fā)生發(fā)展。

OX-LDL主要是由于體內(nèi)的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多并且發(fā)生氧化修飾所產(chǎn)生的，OX-LDL具有細(xì)胞毒性，可以通過多種途徑造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，并且對(duì)于血液中的單核細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成和中膜平滑肌的遷移，是診斷AS的最佳指標(biāo)[23-25]，故降低血液循環(huán)中的OX-LDL水平是預(yù)防AS形成的重要途徑。在內(nèi)皮損傷的過程中，巨噬細(xì)胞釋放出IL-1β、TNF-α、MCP-1等炎癥因子， 炎癥反應(yīng)過程中促使肝細(xì)胞產(chǎn)生大量的hs-CRP急性時(shí)相反應(yīng)物，為此，作者通過檢測(cè)血清中OX-LDL、IL-β、TNF-α、MCP-1、hs-CRP 5個(gè)指標(biāo)來進(jìn)一步探索安化黑茶對(duì)于AS的干預(yù)機(jī)制。

“氧化應(yīng)激學(xué)說”是比較公認(rèn)的引起AS的學(xué)說之一，本次實(shí)驗(yàn)顯示阿托伐他汀和黑茶不同劑量中OX-LDL含量明顯低于模型組，說明阿托伐他汀和黑茶用藥治療均可以起到抗氧化的作用，從而減少了LDL的氧化修飾對(duì)于機(jī)體所造成的損傷。

AS屬于慢性炎性疾病，炎癥反應(yīng)伴隨著AS發(fā)生發(fā)展的始終，抗炎治療被認(rèn)為是治療AS的有效措施。MCP-1作為作用很強(qiáng)的單核細(xì)胞趨化因子，具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞粘附和進(jìn)入動(dòng)脈管壁的雙重功能，其在單核細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜的過程中發(fā)揮著重要的作用，在AS發(fā)生的后期，對(duì)于促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性也起著重要的作用[26]。阿托伐他汀和黑茶不同劑量組均可以有效抑制MCP-1的產(chǎn)生，從而起到了抑制泡沫細(xì)胞合成分泌的作用，延緩了AS的發(fā)生發(fā)展。

TNF-α是一種具有介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的重要的前炎癥因子，可以刺激白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1），白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)過程中，從而發(fā)揮促炎作用，其容易聚集到內(nèi)皮細(xì)胞處造成內(nèi)皮的損傷，為AS的形成創(chuàng)造條件[27-28]。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，阿托伐他汀和黑茶不同劑量組灌胃用藥均可以通過抑制TNF-α的產(chǎn)生來達(dá)到抗炎的作用。

hs-CRP作為一種重要的炎性反應(yīng)標(biāo)志物，其水平的變化可直接反映AS斑塊的炎性反應(yīng)程度[29]。臨床諸多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證C反應(yīng)蛋白與AS的發(fā)生密切相關(guān)，是引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[30]。有研究證實(shí)hs-CRP可以起到調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的作用，可激活補(bǔ)體和刺激組織因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致血管內(nèi)膜的損傷，使得脂類物質(zhì)易于在血管內(nèi)皮聚集，為AS的產(chǎn)生創(chuàng)造了條件[31]。本實(shí)驗(yàn)可觀察到安化黑茶高、中劑量用藥可以有效的抑制hs-CRP的分泌，那么我們推測(cè)安化黑茶可以減少補(bǔ)體的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，防止脂類物質(zhì)在內(nèi)皮表面的附著。

IL-1β作為白介素中重要的基因編碼，主要起著促炎作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證拮抗IL-1β信號(hào)通路可以起到很好的抑制AS發(fā)生的作用[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠血清中IL-1β的含量有所下降，那么既然IL-1β作為重要的促炎因子，它的減少便可以有效的抑制TNF-α、hs-CRP等諸多因子的產(chǎn)生，可以說抑制IL-1β的產(chǎn)生對(duì)于抑制整個(gè)炎癥反應(yīng)其中至關(guān)重要的作用。由此可見黑茶和阿托伐他汀均可以通過拮抗IL-1β信號(hào)通路而起到抗炎的作用。

從以上數(shù)據(jù)分析，安化黑茶延緩AS的發(fā)生可能與以下因素有關(guān)：1）安化黑茶通過抑制脂類物質(zhì)在肝臟和動(dòng)脈管壁的沉積來延緩AS的發(fā)展；2）安化黑茶可以通過抑制 IL-1β、TNF-α、hs-CRP等重要的促炎因子從而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用；3）安化黑茶可以通過抑制MCP-1和OX-LDL等重要的單核細(xì)胞趨化因子來防止過多的泡沫細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的沉積；4.安化黑茶具有抗氧化作用，可以減少LDL的氧化修飾，從而有效的抑制泡沫細(xì)胞的形成和減緩內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

但是AS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，作者只是通過其降脂、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞方面來分析其抗AS的可能機(jī)制。在后期的實(shí)驗(yàn)過程中，我們會(huì)從其他方面來進(jìn)一步的驗(yàn)證，以期全方位、多角度的進(jìn)一步分析其抗AS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。