周靜雨， 陳獻忠*， 張利華， 沈 微， 樊 游

（1. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

啟動子（Promoter）作為基因表達的重要調(diào)控元件，對基因的表達水平有著決定性的作用。 真核生物啟動子結構的復雜性是基因表達多樣性的根本[1]。目前，即使是真核生物中研究最為詳盡的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），預測和微調(diào)啟動子的活性仍然非常困難[2-4]。 就目前而言，真核生物的代謝工程改造仍然依賴于少量定義明確的內(nèi)源啟動子，如GAL1-10，TEF 和LEU2 啟動子等[5-7]。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）作為一種二倍體的非常規(guī)酵母， 胞內(nèi)存在一些特殊的代謝途徑，能夠利用木糖、烷烴和脂肪酸等一些非常規(guī)底物作為唯一碳源進行生長，并且在代謝過程中積累一些重要的化工原料，如長鏈二元有機酸等[8]。 因而，熱帶假絲酵母具有較高的工業(yè)應用前景，但是目前可供用作代謝改造的、功能確切的啟動子只有少數(shù)，如3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）[9]啟動子和異檸檬酸裂解酶（ICL）啟動子[10]。前者為轉錄活性較強的組成型啟動子，后者為受乙酸鹽強烈誘導的誘導型啟動子。 在微生物代謝途徑中，選用不合適的啟動子有可能導致代謝途徑被限速或中間產(chǎn)物的過量積累，而使用活性適當?shù)膯幼涌梢云胶馕⑸矬w內(nèi)的代謝途徑，降低中間產(chǎn)物積累，進而提高熱帶假絲酵母發(fā)酵過程中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率[11]。因此啟動子數(shù)量的限制，一定程度上限制了熱帶假絲酵母代謝工程的研究。

作者以磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）啟動子為研究對象。 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已公布的PGK1 序列， 通過多重序列比對獲得啟動子上游的保守序列，根據(jù)保守序列設計引物PCR 擴增熱帶假絲酵母的PGK1 啟動子， 然后對該啟動子的序列進行分析并以yeGFP3 作為報告基因，通過啟動子5' 端逐步截短，對啟動子上游調(diào)控元件的功能進行初步鑒定和分析。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

本文中用到的質(zhì)粒Ts-CAT2-gda324-URA3和Ts-yeGFP3[12]，菌株熱帶假絲酵母ATCC 20336、熱帶假絲酵母XZX 和大腸桿菌JM109 均由本研究中心保藏。 所涉及到的菌株如表1 所示：

表1 本實驗所用到的菌株Table 1 Strains used in this paper

實驗過程中所用酶類、載體pMD 19-T Simple、實時熒光定量所用到的試劑盒Yeast RNAiso Kit、PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBRPremix Ex TaqTMKit， 均購買自Takara 公司。 質(zhì)粒小提試劑盒、PCR 產(chǎn)物清洗試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，購自AxyPrep 公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；

MM 培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L，硫酸銨10 g/L，葡萄糖20 g/L；

SM 培養(yǎng)基：MM 培養(yǎng)基中添加0.006 g/dL的尿嘧啶；

氨芐青霉素質(zhì)量濃度：100 mg/L。

1.3 方法

1.3.1 熱帶假絲酵母基因組DNA 的提取 熱帶假絲酵母基因組DNA 提取方法參考文獻[12]進行操作。

1.3.2PGK1啟動子的擴增與yeGFP3表達盒的構建PGK1基因的PCR 擴增： 以熱帶假絲酵母ATCC 20336 基 因 組DNA 為 模 板，PGKP/PGKT 為 引 物，PCR 擴增獲得PGK1基因（P-ORF-T）。 經(jīng)AxyPrep公司的PCR 產(chǎn)物清洗試劑盒純化后， 連接到pMD 19-T Simple 載體，得到重組質(zhì)粒Ts-PGK1。 重組質(zhì)粒送蘇州泓迅生物技術有限公司進行測序， 得到PGK1的基因序列。

以熱帶假絲酵母ATCC 20336 基因組DNA 為模板，PGK1/PGK3 和PGK6/PGK8 為引物，分別擴增PGK1基因的啟動子PGK1P（以下稱為P846）和終止子PGK1T（以下稱為T）。以質(zhì)粒Ts-yeGFP3為模板，PGK4/PGK5 為引物，PCR 擴增報告基因yeGFP3。

將擴增所得的P846、yeGFP3和T片段等摩爾加入融合PCR（SOE PCR）反應體系：PrimeSTARHS酶0.5 μL，5×PrimeSTARBuffer 10 μL，dNTPs 4 μL，P8461 μL，yeGFP32 μL，T1 μL 和ddH2O 31.5 μL。反應條件：98 ℃3 min；98 ℃10 s，55 ℃2 min，72 ℃2 min，10 個循環(huán)；72 ℃10 min。 以10 μL 上述融合反應液為模板，重新配置PCR 反應體系：PrimeSTARHS酶0.5 μL，5×PrimeSTARBuffer 10 μL，dNTPs 4 μL，融合反應液10 μL， 引物PGK2/PGK7 各1 μL 和ddH2O 22.5 μL。 反應條件：98 ℃3 min；98 ℃10 s，55 ℃1 min，72 ℃2 min，30 個循環(huán)；72 ℃，10 min， 獲得P846-yeGFP3-T表達盒。 本實驗中所用引物見表2。

表2 本文中所用引物Table 2 Primers used in this paper

1.3.3 重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3的構建與轉化PstI/SalI 雙酶切P846-yeGFP3-T表達盒， 然后插入到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的載體Ts-CAT2-gda324-URA3中，替換其中的gda324片段。之后將連接產(chǎn)物轉化JM109， 獲得重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3，并通過PstI 和SalI對重組質(zhì)粒進行酶切驗證。 然后以質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3為模板，CAT2ndU/CAT2ndR為引物，PCR 擴增yeGFP3基因整合表達盒CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3-CAT2，經(jīng)PCR 產(chǎn)物清洗試劑盒純化后通過氯化鋰轉化法[13]轉化尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型熱帶假絲酵母宿主XZX。 利用2 段CAT基因片段作為同源臂， 通過同源重組將yeGFP3表達盒整合到CAT位點，經(jīng)MM 平板篩得轉化子后提取轉化子基因組，以URA3F/CATR 為鑒定引物進行PCR驗證（圖1）。

圖1 yeGFP3 基因表達盒的轉化Fig. 1 Physical map of the expression cassette and integration of the cassette into the CAT locus of C. tropicalis XZX

1.3.4yeGFP3的檢測 綠色熒光蛋白在紫外激發(fā)光（488 nm）的照射下可發(fā)射綠色熒光[14]，根據(jù)這一特征對yeGFP3的表達效果進行檢測。 將轉化子接種到SM 培養(yǎng)基中，200 r/min，30 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600：2～4）， 然后置于4 ℃靜置數(shù)小時用于穩(wěn)定綠色熒光蛋白的折疊狀態(tài)。 隨后取1 mL 培養(yǎng)液12000 r/min 離心1 min 收集菌體， 經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗菌體2 次后重懸于PBS 緩沖液中[15]。通過Nikon 80i 正置熒光顯微鏡以488 nm 的激發(fā)光激發(fā)后進行熒光觀察并拍照記錄。

將轉化子培養(yǎng)液用PBS 緩沖液重懸， 控制OD600在0.3～0.5， 吸取200 μL 樣品至96 孔黑色酶標板中， 將酶標板置于BioTek Cytation 5 細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)， 在488 nm/520 nm 處檢測熒光強度，并對轉化子的熒光信號作定量分析。 以出發(fā)菌株XZX 作為陰性對照。

1.3.5 mRNA 提取和實時熒光定量PCR 根據(jù)參考文獻[12]對熱帶假絲酵母轉化子進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析。 挑取平板上的熱帶假絲酵母單菌落接種于液體SM 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)， 然后以此作為種子液轉接到新鮮的SM 液體培養(yǎng)基中，待菌體OD600值達到1.5～2.5 后，使用酵母Total RNA 提取試劑盒提取菌株中總RNA。 使用PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒對上述RNA 進行反轉錄，獲得單鏈cDNA。 使用SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒， 以cDNA 作為模板，ACT1 為內(nèi)參基因，應用CFX96 Real-Time PCR Detection System 擴增儀進行RT-qPCR 檢測。 RTqPCR 反應按照95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)進行；溶解曲線按照65 ℃至95 ℃，每5 s 升溫0.5 ℃進行繪制。

2結果與討論

2.1 PGK1 基因的克隆

圖25株假絲酵母PGK1 基因多重序列比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of five PGK1 genes

參照GenBank 中已公布的5 株假絲酵母屬菌株中的PGK1基因序列（登錄號：FM992693.1、CP017628.1、LT635760.1、HE605202.1 和HE681724.1），分別截取5 株菌的PGK1結構基因上游約1200 bp 序列進行多重序列比對，經(jīng)過比對獲得一段同源性極高的序列（圖2（a）），在此基礎上設計PGK1基因上游引物PGKF。 以同樣方法設計終止子下游引物PGKR（圖2（b））。

以熱帶假絲酵母ATCC 20336 基因組DNA 為模板，PGKF/PGKR 為引物，PCR 擴增獲得一段長度為3000 bp 的片段（圖3），將片段連接到pMD 19-T Simple 載體中，然后進行測序分析。 對上述基因的測序結果進行分析， 發(fā)現(xiàn)該基因的編碼區(qū)與Candida albicansSC5314 和Candida dubliniensisCD36 菌株的堿基序列相似度為81.8%，氨基酸相似度為92%；與Candida parapsilosisCDC317 和Candida orthopsilosisCo 90-125 菌株的堿基序列相似度為78%，氨基酸相似度為91%；與Candida intermediaCBS 141442 菌株的堿基序列相似度為76%，氨基酸相似度為86.8%。 因此可以判斷所擴增得到的基因為PGK1。

圖3 PGK1 基因克隆與電泳分析Fig. 3 Amplification of PGK1 gene

2.2 PGK1 啟動子的功能鑒定

重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P-yeGFP3-T-URA3構建過程如圖4（c）所示。 分別PCR 擴增報告基因yeGFP3、PGK1的啟動子P846和終止子T，通過融合PCR 構建yeGFP3表達盒P846-yeGFP3-T（圖4（a））。 用表達盒替換載體Ts-CAT2-gda324-URA3中的gda324片段， 獲得重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-TURA3。 用PstI 和SalI 對重組質(zhì)粒進行雙酶切，得到5 kb 的載體片段和2.1 kb 的yeGFP3表達盒片段（圖4（b））。將構建完成的表達盒通過氯化鋰轉化法轉化XZX 菌株并篩選獲得轉化子，陽性轉化子命名為C. tropicalisP-4（圖6，泳道4）。 在熒光顯微鏡下觀察到P-4 菌株具有清晰的綠色熒光（圖7），由此可以確認PGK1啟動子具有活性。

圖4 P846-yeGFP3-T 表達盒的融合構建、Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3 的酶切驗證、 重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3 的構建流程Fig. 4 Construction of P846-yeGFP3-T cassette by SOE PCR，Restriction analysis of plasmid Ts-CAT2-P846-yeGFP3-TURA3 and construction of the recombinant plasmid Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3

2.3 啟動子的截短與yeGFP3 表達盒構建

通過在線啟動子分析網(wǎng)站promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/） 分析PGK1啟動子序列， 分析結果顯示在啟動子-500 bp 處存在一個可能的功能元件， 在-139 bp 處存在一個可能的TATA 框，-84 bp 處和-240 bp 處存在2 個可能的CAAT 框。因此將PGK1啟動子劃分為300 bp（以下稱該長度啟動子為P300）、550 bp（以下稱該長度啟動子為P550） 和750 bp （以下稱該長度啟動子為P750）3 個長度進行分析。

分別以PGK1F（300）/PGK7、PGK1F（550）/PGK7和PGK1F（750）/PGK7 為引物，重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P846-yeGFP3-T-URA3為模板，PCR 擴增得到不同長度PGK1啟動子調(diào)控下的yeGFP3表達盒，用PstI/SalI 雙酶切后連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的載體Ts-CAT2-gda324-URA3中， 分別構建重組質(zhì)粒Ts-CAT2-P300-yeGFP3-T-URA3、Ts-CAT2-P550-yeGFP3-T-URA3和Ts-CAT2-P750-yeGFP3-TURA3。 用PstI/NdeI 雙酶切， 得到啟動子加部分yeGFP3的片段，大小依次為530、780、980 bp 和1076 bp，和2 段約3000 bp 的片段（因大小相差過小電泳難以分開，圖5）。 分別以上述3 個重組質(zhì)粒為模板，CAT2ndU/CAT2ndR 為引物， 擴增yeGFP3表達盒CAT2 -P300 -yeGFP3 -T -URA3 -CAT2、CAT2-P550-yeGFP3-T-URA3-CAT2和CAT2-P750-yeGFP3-T-URA3-CAT2。

2.4 yeGFP3 基因表達盒的轉化與鑒定

圖5 重組質(zhì)粒的酶切驗證Fig. 5 Restriction analysis of recombinant plasmids

分別將4 個不同長度啟動子調(diào)控下的yeGFP3表達盒轉化XZX 菌株， 用MM 平板篩選轉化子，提取轉化子基因組，使用URA3F/CATR 引物進行PCR驗證， 陽性轉化子可擴增得到2.3 kb 的條帶，而XZX 菌株則無特異性擴增條帶（圖6）。 分別命名陽性轉化子為P-1、P-2、P-3 和P-4。

2.5 轉錄水平和翻譯水平表征各截短啟動子的強度

圖6 截短啟動子的yeGFP3 表達盒整合轉化子的PCR 鑒定Fig.6 Identification of truncated promoter cassette by PCR

PGK1啟動子為組成型啟動子， 能夠在菌體生長過程中穩(wěn)定的進行表達，且不需要添加誘導物。在SM 液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)P-1、P-2、P-3、P-4 和出發(fā)菌株XZX 至OD6002～4， 然后用熒光顯微鏡觀察記錄各轉化子中yeGFP3基因的表達情況并進行定性分析。熒光顯微鏡結果顯示，yeGFP3在P-1 和P-2 菌株中表達極弱，幾乎無法觀察到熒光；P-3 菌株中yeGFP3表達水平較高， 在紫外激發(fā)光下可以看見明顯的綠色熒光； 而在P-4 中yeGFP3表達水平最高，能夠清晰的觀察到強烈的綠色熒光（圖7）。熒光檢測結果顯示，PGK1啟動子序列越完整，細胞的熒光強度越強。

圖7 熱帶假絲酵母轉化子中綠色熒光蛋白的檢測Fig. 7 Observation of yeGFP3 in C. tropicalis XZX

使用BioTek Cytation 5 細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)對4 個轉化子中綠色熒光蛋白的表達水平進行定量分析， 檢測結果與熒光顯微鏡觀察結果一致，P-1、P-2 和P-3 菌株中的相對熒光強度較P-4 菌株低，分別為P-4 菌株的4.98%、9.84%和48.4%（圖8）。

圖8 熱帶假絲酵母轉化子的相對熒光強度（RFU/OD600）Fig. 8 Relative fluorecence intensity of the five strains

由于轉化子P-1 和P-2 所表達的綠色熒光極為微弱，為進一步確定550 bp 以下的啟動子片段是否具有轉錄活性，并分析不同長度啟動子調(diào)控下的蛋白表達水平與mRNA 轉錄水平是否一致，分別提取上述5 株菌的總RNA， 并進行RT-qPCR 分析。RT-qPCR 實驗結果顯示P-1 和P-2 菌株中PGK1啟動子僅有較低的轉錄活性， 轉化子中yeGFP3的轉錄水平分別為P-4 菌株的5.6%、13.8%，而yeGFP3在P-3 菌株中的轉錄水平達到了P-4 菌株的60%（圖9）。 該數(shù)據(jù)與BioTek Cytation 5 細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)結果一致。

圖9 不同熱帶假絲酵母轉化子中yeGFP3 基因的mRNA相對豐度分析Fig.9 mRNA levels of different yeGFP3 genes in transformants

3結 語

GFP 作為一種從水母中克隆得到的熒光蛋白，無需輔助因子，經(jīng)紫外光激發(fā)即可發(fā)射綠色熒光[16]，被廣泛用于啟動子的功能研究。 本文選用密碼子優(yōu)化的酵母增強型GFP（yeGFP3）作為報告基因[17]，對熱帶假絲酵母的PGK1啟動子功能進行鑒定。

PGK1 是糖酵解途徑中的關鍵酶，在糖酵解第2個階段的第2 步中催化1，3-二磷酸甘油酸轉變3-磷酸甘油酸并產(chǎn)生1 分子ATP。PGK1啟動子在酵母中具有較強的啟動活性，在酵母代謝改造中常被用作強啟動子啟動外源基因的轉錄[18]。 且PGK1啟動子是組成型啟動子，可以在廉價碳源如葡萄糖中穩(wěn)定表達外源蛋白，不需要添加誘導物，因此選擇熱帶假絲酵母中的PGK1啟動子為研究對象。 根據(jù)在線啟動子分析網(wǎng)站（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）對PCK1啟動子調(diào)控元件的預測結果，以XZX 為出發(fā)菌株， 構建了P-1、P-2、P-3 和P-4 四株重組菌，分別以不同長度（300、550、750 bp 和846 bp）的PGK1啟動子來調(diào)控yeGFP3表達。 通過比較4 株重組菌中yeGFP3的表達差異來探索PGK1啟動子的調(diào)控元件所在區(qū)域。 實驗結果顯示：550 bp以下的PGK1啟動子片段轉錄活性極低且重組菌的熒光微不可查， 推測在-550 bp 以下無功能元件或者在-550 bp 處功能元件被截斷， 以至于未能發(fā)揮應有的輔助轉錄功能；750 bp 的PGK1啟動子片段有較明顯的轉錄活性且重組菌的熒光清晰可見，該結果可證明-750 bp 之前確有功能元件且為UAS，但具體序列大小與存在位置需后續(xù)實驗做進一步的確認；最后846 bp 的PGK1啟動子片段具有高于750 bp 的轉錄活性且重組菌熒光信號穩(wěn)定，可能在750 bp 上游至少還有1 個UAS。 因此初步判斷PGK1啟動子中至少存在2 個UAS。

外源基因的轉錄是一個較為復雜的過程， 基于分離不同長度的啟動子功能的比較研究， 下一步的工作是對PGK1啟動子的2 個可能的UAS 進行詳細分析，分離獲得明確的功能序列。 再對PGK1啟動子進行改造， 將獲得的UAS 分別在PGK1上游進行串聯(lián)表達，得到一個轉錄活性更強的雜合啟動子，為以后在熱帶假絲酵母中高效表達外源基因奠定基礎。