張 權(quán)， 酉相成， 陳修來， 劉 佳， 羅秋玲， 劉立明*

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫214122）

硫酸軟骨素（sulfated chondroitin，CS）是一類硫酸化的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG），由葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（UDPGalNAc）通過β1→3 或者β1→4 糖苷鍵交替連接而成[1]。 根據(jù)二糖單位中硫酸基團數(shù)量和位置的差異，CS 可以分為A、B、C、D、E、F 等類型， 動物來源的CS 單體多為CS-A，C[2]。 CS 存在于動物軟骨組織中，具有良好的生物活性和藥用價值，廣泛用于醫(yī)藥行業(yè)，食品保健品行業(yè)和護膚化妝品行業(yè)[3-5]。 CS的生產(chǎn)方法包括動物組織提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法。 由于原材料匱乏，生產(chǎn)周期較長，提取工藝復雜，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴重等缺點，嚴重制約了CS 的工業(yè)化生產(chǎn)[6-8]。 微生物發(fā)酵法與上述方法相比有著獨特的優(yōu)勢，微生物利用廉價的營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)高價值的CS， 能夠顯著降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益；發(fā)酵液提取與純化工藝過程較其他方法簡單，得到的產(chǎn)品質(zhì)量安全穩(wěn)定；此外，發(fā)酵法具有環(huán)境友好、低污染等優(yōu)勢[9-10]。

Escherichia coliK4 作為軟骨素及其類似物的主要生產(chǎn)菌株，其莢膜多糖（capsular polysaccharide,CPS） 是由UDP-GlcA 和UDP-GalNAc 通過β1→3或者β1→4 糖苷鍵交替連接而成， 并且UDP-GlcA的C-3 位置被果糖基團所取代[11]。 近年來，國內(nèi)外學者從生化工程和代謝工程2 個方向研究軟骨素及其類似物的生產(chǎn)。 Cimini 團隊以E. coliK4 作為出發(fā)菌株進行營養(yǎng)條件的優(yōu)化， 選擇葡萄糖和甘油，酪蛋白和大豆蛋白胨分別作為碳源和氮源進行搖瓶實驗。 最終選擇甘油和大豆蛋白胨進行2-L 罐進行發(fā)酵實驗，此時最大的細胞密度為56 gcww/L，對應的CPS 產(chǎn)量為1.4 g/L[12]。 Restaino 課題組通過向培養(yǎng)基中添加K4 CPS 的前體物質(zhì)UDP-GlcA 和UDP-GalNAc、果糖，果糖軟骨素的產(chǎn)量提高了68%和57%[13]。 然而這些生化工程策略并不能從根本上解決果糖軟骨素低產(chǎn)量、低產(chǎn)率、低生產(chǎn)強度的問題。 因此，學者從代謝工程方向?qū). coliK4 菌株進行代謝改造提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。 K4 CPS 屬于Group II K 抗原， 一共可以分為3 個功能區(qū)[14]。Region 1 和region 3 作為Group II 保守基因， 主要負責多糖的修飾和轉(zhuǎn)運。 Region 2 根據(jù)不同類型的K 抗原而有所差異，K4 CPS 基因簇全長14 kb，包括7 個基因（kfoA, kfoB…kfoG）和一個轉(zhuǎn)座元件IS2，總結(jié)于表1。 其中部分基因已經(jīng)作為代謝工程靶點進行改造，例如啟動子工程策略：利用不同強度的啟動子Trc 和T7 過量表達軟骨素合成酶KfoC，工程菌株BK4063 產(chǎn)量較原菌提高了113%[15]；轉(zhuǎn)錄工程策略：利用誘導型表達載體和組成型表達載體過表達全局調(diào)控因子SlyA[16]和轉(zhuǎn)座子策略表達抗終止子RfaH[17]，果糖軟骨素的產(chǎn)量均有所提高；基因敲除策略： 利用Red 同源重組技術(shù)敲除果糖轉(zhuǎn)移酶KfoE，終產(chǎn)物為軟骨素[18]。 此外，Cimini 課題組還研究了前體UDP-GlcA 合成路徑上的葡萄糖磷酸變位酶PGM 和焦磷酸化酶GalU 對莢膜多糖合成的影響， 即在重組菌株EcK4r3 中過量表達pgm和galU。雖然pgm和galU的表達量較對照菌株分別提高了1.6 和1.3 倍， 但是莢膜多糖的產(chǎn)量并未發(fā)生變化，然而在添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，莢膜多糖的產(chǎn)量卻提高了45%[19]， 因此我們推測前體UDPGalNAc 合成路徑對莢膜多糖的生產(chǎn)可能具有促進作用。

為探究前體UDP-GalNAc 合成路徑對果糖軟骨素生產(chǎn)的影響， 本研究中選擇關(guān)鍵酶GlmS 和GlmM 強化UDP-GalNAc 路徑（圖1）。 首先分別單獨過量表達glmM和glmS基因，為增強底物之間的轉(zhuǎn)化效率，構(gòu)建了融合蛋白glmM-glmS，然后通過利用不同表達強度的核糖體結(jié)合位點（Ribosome binding site，RBS） 控制融合蛋白起始翻譯速率，從而控制融合蛋白的表達強度，最終獲得了最優(yōu)工程菌株E. coliK4-H-glmM-glmS。

表1 K4 CPS 合成涉及的蛋白質(zhì)[14]Table 1 Proteins involved in the biosynthesis of K4 CPS[14]

圖1 K4 CPS 的生物合成路徑Fig. 1 Synthesis pathway of CPS in E. coli K4

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 pTrcHisA 載體， 大腸桿菌JM109 為本實驗室保存；pETM6R1 載體由pETM6載體改變啟動子區(qū)域而來；pETM6 載體， 購買于美國Addgene 公司；大腸桿菌K4，購買于美國菌種保藏中心（ATCC）。 本研究所用質(zhì)粒和菌株詳見表2。

表2 本研究所用的質(zhì)粒和菌株Table 2 Plasmids and strains used in this study

續(xù)表2

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶AvrII、SalI、SpeI、XbaI、XhoI，Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶，DNA marker，購自大連寶生物工程公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、咔唑、葡萄糖醛酸，購自生工生物工程（上海）公司；細菌基因組提取試劑盒，購自天根公司；PCR 引物（表2）由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。 PCR 擴增儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀Green Pulser、核酸電泳儀，購自美國Bio-rad 公司；5-L 發(fā)酵罐，購自上海保興生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 1.4，（NH4）2HPO41.4，KH2PO413.5，檸檬酸1.7，甘油20，維生素B14.5 mg/L，金屬離子液10 mL/L。

補料培養(yǎng)基（g/L）：甘油500，MgSO4·7H2O 10，維生素B10.2。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌15 min，維生素B1 過濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法 取保存于含體積分數(shù)15%甘油的菌液100 μL，接種到裝有培養(yǎng)基25 mL/250 mL的搖瓶中，加入質(zhì)量濃度為100 mg/mL 氨芐青霉素25 μL，在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)10 h 待用。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵 將種子液按發(fā)酵總體積1%的接種量，接種到裝液量50 mL/500 mL 的搖瓶中，添加質(zhì)量濃度為100 mg/mL 氨芐青霉素50 μL，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)37 h。 當OD600達到0.6～0.8 時，采用0.2～1.0 mmol/L 的IPTG 進行誘導，誘導溫度為25～42 ℃。

1.2.35 L 罐補料分批發(fā)酵 采用5 L 發(fā)酵罐進行補料分批發(fā)酵。 發(fā)酵罐初始裝液量為2.5 L。 將種子液按總體積10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，菌體濃度（OD600）達到10.0 左右時，采用0.4 mmol 的IPTG進行誘導。 初始條件：轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為1.0 vvm，pH 為7.0。 發(fā)酵過程中通過流加氨水控制pH 至7.0。 培養(yǎng)7 h，發(fā)酵液的溶氧值陡然上升，20 g/L 的初始甘油消耗完全， 此時即啟動2 種補料模式。當采用DO-stat 補料模式時，先通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在30%以上，補料時流加補料培養(yǎng)基將溶氧控制在30%以下；當采用恒速補料模式時，補料培養(yǎng)基的流加速率為20 mL/h，整個發(fā)酵周期為37 h（見圖5（a），（b））。

1.3 工程菌株的構(gòu)建

1.3.1 表達載體的構(gòu)建 結(jié)合The RBS calculator v2.0， 在線預測得到了3 組不同強度的RBS 序列，如表3 中斜體部分所示[20]。 以RBS-Si(i: L, M, H)/RBS-A 為引物 對，pET-28a-eGFP 為模板， 擴增eGFP基因。分別使用限制性內(nèi)切酶XbaI 和XhoI 對表達載體pETM6R1 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進行雙酶切。 酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 中，得到表達載體pETM6R1 -RBSL-GFP、pETM6R1 -RBSM-GFP、pETM6R1-RBSH-GFP。

以E. coliK4 基因組為模板，引物對KZ-glmMS/KZ-glmM-A 和KZ-glmS-S/KZ-glmS-A （表3）分別擴增基因glmM和glmS。 分別使用限制性內(nèi)切酶BamHI 和XhoI 對表達載體pTrcHisA 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進行雙酶切。 酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進行連接， 轉(zhuǎn)化至E. coliJM109中， 得到表達載體pTrcHisA-glmM、pTrcHisA-glmS。

以E.coliK4 基因組為模板， 引物對RHglmM-S/RH-glmM-A 和RH-glmS-S/RH-glmS-A（表3）分別擴增基因glmM和glmS。然后以glmM 和glmS 為模板，引物對RH-glmM-S/RH-glmS-A 進行融合PCR 得到融合蛋白glmM-glmS，融合蛋白通過寡肽連接子“GGGS”相連[21]。

以融合蛋白glmM-glmS 為模板， 引物對LglmM -glmS -S/glmM -glmS -A，M -glmM -glmS -S/glmM-glmS-A，H-glmM-glmS-S/glmM-glmS-A PCR擴增得到不同表達強度的融合蛋白glmM-glmS。 分別使用限制性內(nèi)切酶XbaI 和XhoI 對表達載體pETM6R1 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進行雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 中，得到表達載體pETM6R1-L -glmM -glmS，pETM6R1 -M -glmM -glmS 和pETM6R1-H-glmM-glmS（圖2）。

表3 本研究中所用的引物Table 3 Primers used in this study

圖2 表達載體的構(gòu)建過程Fig. 2 Process of constructing expression vector

1.3.2 E. coli K4 的轉(zhuǎn)化與重組子的鑒定 E. coli K4 的轉(zhuǎn)化采用電擊轉(zhuǎn)化方式，轉(zhuǎn)化后涂布于含100 mg/mL 氨芐青霉素的篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進行PCR 驗證。 獲得工程菌株E. coli K4-RBSL-GFP、E. coli K4-RBSM-GFP、E. coli K4-RBSH-GFP、E. coli K4-glmM，E. coli K4-glmS，E.coli K4-glmM-glmS，E. coli K4-L-glmM-glmS，E.coli K4-M-glmM-glmS，E. coli K4-H-glmM-glmS。

1.4 果糖軟骨素的定量檢測

1.4.1 GFP 表達檢測 菌體在用0.4 mmol/L IPTG誘導后，每隔2 h 檢測一次熒光密度的測定，具體方法參照Gao et al., 2017[22]。

1.4.2 果糖軟骨素的定量檢測 采用硫酸咔唑法測量果糖軟骨素的產(chǎn)量[23]。 發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心5 min，取上清液加入一定量乙醇，過夜放置，沉淀雜質(zhì)，離心去除樣品上清液，適當烘干去除乙醇后，加入1 mL 超純水復溶；在冰浴的25 mL具塞比色試管中加入配置好的5 mL 硼酸鹽硫酸溶液（25 mmol/L 四硼酸鈉），再加入1 mL 經(jīng)超純水復溶的樣品混勻，沸水浴10 min 后冰浴冷卻。 向冷卻的試管中加入100 μL 咔唑-乙醇試劑（0.125 g/dL）混勻，沸水浴15 min 后冰浴冷卻；以超純水為空白對照，50 mg/L D-葡萄糖醛酸為標準品，按上述方法測定標準曲線，再進行濃度換算。

2結(jié)果與分析

2.1 路徑酶GlmM、GlmS 的過量表達對果糖軟骨素合成的影響

通過在E. coli K4 中表達磷酸葡糖胺變位酶GlmM 獲得了重組菌株E. coli K4-glmM， 果糖軟骨素的產(chǎn)量、單位細胞的生產(chǎn)能力、單位甘油的生產(chǎn)能力分別達到了138.71 mg/L、57.09 mgK4CPS/gDCW、9.96 mgK4CPS/g甘油，較對照菌株E. coli K4 分別提高了35.98%、42.12%、45.19%（圖3）。 該結(jié)果表明，在胞質(zhì)中過量表達GlmM 能將更多的碳流導向UDPGalNAc，進而提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。

通過在E. coli K4 中表達葡萄糖胺合酶（GlmS）獲得了重組菌株E. coli K4-glmS 中，果糖軟骨素的產(chǎn)量、單位細胞的生產(chǎn)能力、單位甘油的生產(chǎn)能力分 別 達 到 了153.63 mg/L、61.86 mgK4CPS/gDCW、10.21 mgK4CPS/g甘油，較重組菌株E. coli K4-glmM 分別提高了10.77%、8.36%、2.51%（圖3）。 該結(jié)果表明，在胞質(zhì)中過量表達GlmS 能夠有效的疏導碳流至UDPGalNAc，從而提高了果糖軟骨素的產(chǎn)量。

為了增強Fru-6-P 到UDP-GalNAc 的轉(zhuǎn)化效率，構(gòu)建了融合蛋白glmM-glmS，并在野生型E. coli K4 中進行過量表達。 結(jié)果表明， 重組菌株E. coli K4-glmM-glmS 的果糖軟骨素生產(chǎn)能力獲得了較大幅度的提高，達到了191.23 mg/L，較E. coli K4 和E. coli-glmS 分別提高了87.48%和24.47%（圖3）。該結(jié)果表明， 融合蛋白glmM-glmS 能夠?qū)⒏嗟腇ru-6-P 代謝流導向前體UDP-GalNAc， 從而強化了進入果糖軟骨素的碳流。

圖3 工程菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig. 3 Fermentation of engineered strains in shake flask

2.2 融合蛋白glmM-glmS 的表達水平對果糖軟骨素合成的影響

為了進一步精細化控制果糖軟骨素合成路徑，通過優(yōu)化融合蛋白glmM-glmS 的表達水平，提高果糖軟骨素的生物合成能力。 首先，實驗得到的相對熒光強度分別與預測的RBS 序列強度一致（圖4）。通過在引物上添加不同強度的RBS 序列得到不同表達水平的融合蛋白glmM-glmS，成功構(gòu)建了3 株工程菌株E. coliK4-L-glmM-glmS、E. coliK4-MglmM-glmS、E. coliK4-H-glmM-glmS。

重組菌株E. coliK4-L-glmM-glmS 的果糖軟骨素的生產(chǎn)能力和單位細胞生產(chǎn)K4CPS 的能力為103.54 mg/L 和46.87 mgK4CPS/gDCW，較對照菌株E. coliK4-glmM-glmS 下降了45.86%和35.42%。表明低強度的融合蛋白glmM-glmS 不能有效地提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。 然而，重組菌株E. coliK4-M-glmMglmS 和E. coliK4-H-glmM-glmS 搖瓶發(fā)酵，果糖軟骨素的產(chǎn)量分別為200.21 mg/L 和334.50 mg/L，較重組菌株E. coliK4-glmM-glmS 分別提高了4.70%、74.92%。 重組菌株E.coliK4-H-glmM-glmS 單位細胞生產(chǎn)K4CPS 的能力和單位甘油生產(chǎn)K4CPS 的能力分別為114.67 mgK4CPS/gDCW和21.42 mgK4CPS/g甘油，較菌株E. coliK4-glmM-glmS 分別提高了58.80%和69.33%（見表4）。 上述結(jié)果表明， 優(yōu)化融合蛋白glmM-glmS 的起始翻譯速率能夠提高融合蛋白的表達強度，進而強化了果糖軟骨素的合成能力。

圖4 RBS 序列表達水平的確定Fig. 4 The expression level of RBS sequence

表4 菌株搖瓶發(fā)酵參數(shù)Table 4 The fermentation parameters of engineered strains in shake flask

2.3 誘導策略對果糖軟骨素產(chǎn)量的影響

為了高效表達融合蛋白glmM-glmS，借助工程菌株E. coliK4-H-glmM-glmS， 優(yōu)化了誘導溫度和誘導劑濃度。 首先研究了誘導劑IPTG 的濃度對菌株E. coliK4-H-glmM-glmS 生產(chǎn)果糖軟骨素的影響，結(jié)果如圖5（a）所示。 隨著誘導劑濃度的不斷提高，果糖軟骨素的合成能力不斷增強。 當IPTG 濃度為0.4 mmol/L 時，果糖軟骨素合成能力最強，達到了340.25 mg/L，當超過0.4 mmol/L 時，K4CPS 的合成能力不斷減弱，并且菌體生長受到抑制。

其次研究了誘導溫度對菌株E. coliK4-HglmM-glmS 生產(chǎn)果糖軟骨素的影響，結(jié)果如圖5（b）所示。當誘導溫度為25 ℃時，K4CPS 合成能力最弱，此時的OD600為5.32，當誘導溫度為37 ℃時，K4CPS的合成能力最強，達到了340.25 mg/L，菌體OD600為7.08，當誘導溫度為42 ℃時，K4CPS 產(chǎn)量開始下降。上述結(jié)果表明最佳IPTG 濃度和誘導溫度分別為0.4 mmol/L 和37 ℃。

圖5 誘導策略對菌體生長和K4CPS 生產(chǎn)的影響Fig. 5 Effects of induction strategy on cell growth and production of K4CPS

圖6 補料模式對菌株生長和K4CPS 生產(chǎn)的影響Fig. 6 Effects of feeding mode on cell growth and production of K4CPS.

2.45 L 罐補料分批發(fā)酵

為了進一步提高果糖軟骨素的產(chǎn)量，將最優(yōu)工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 在5-L 發(fā)酵罐上的2 種補料策略優(yōu)化， 即DO-stat 補料模式和恒速補料模式（圖6）。

采用恒速補料策略，發(fā)酵36 h，工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 的OD600達到了90.4，K4CPS 的產(chǎn)量、單位細胞的生產(chǎn)能力和甘油的生產(chǎn)能力分別為為3.39 g/L、91.02 mgK4CPS/gDCW和21.05 mgK4CPS/g甘油，采用DO-stat 補料策略，發(fā)酵37 h，工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 的OD600達到了76.4， 較恒速補料策略降低了15.48%；K4CPS 的產(chǎn)量、 單位細胞的生產(chǎn)能力和甘油的生產(chǎn)能力分別為3.99 g/L、126.12 mgK4CPS/gDCW和29.01 mgK4CPS/g甘油，較恒速補料策略分別提高了17.70%、38.56%和37.81%（見表5）。 此結(jié)果表明，DO-stat 補料模式有利于菌株生產(chǎn)K4CPS，而恒速補料模式更有利于菌體生長。

2.5 討論

表5 工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 在不同補料模式下的發(fā)酵情況Table 5 The fermentation parameters of E. coli K4-H-glmM-glmS in the 5 L fermentor

利用果糖軟骨素生產(chǎn)菌株E. coli K4 作為代謝改造的宿主，由于代謝路徑之間的競爭導致果糖軟骨素的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度較低。 本文以野生型E. coli K4 為出發(fā)菌株， 在原有代謝路徑的基礎(chǔ)之上，分別研究了過量表達glmM、glmS，結(jié)果表明果糖軟骨素的產(chǎn)量較野生型菌株均有所提高。

果糖軟骨素生物合成路徑中關(guān)鍵酶的融合不僅能夠避免多步代謝路徑中競爭性酶對底物的降解與轉(zhuǎn)化，而且蛋白質(zhì)復合體的形成能夠拉近不同活性中心位點的空間距離、有利于形成更加有效地底物傳輸通道[21]。 此外，研究還表明，蛋白質(zhì)復合體的形成可以阻止底物和某些中間代謝物的降解進而提高特殊代謝路徑的效率[24]。 關(guān)鍵酶融合表達策略廣泛用于富馬酸、次丹參酮二烯的生物合成[21，25]。

目標產(chǎn)物的合成與微生物的生長息息相關(guān)。 在搖瓶發(fā)酵過程中，果糖軟骨素的產(chǎn)量與菌株的生物量呈現(xiàn)正相關(guān)性。 最優(yōu)菌株E. coli K4-H-glmMglmS 果糖軟骨素的產(chǎn)量與生物量達到最大時，與野生型菌株E. coli K4 相比， 分別提高了227.94%、14.96%。 可能的原因是果糖軟骨素屬于一種莢膜多糖，在菌株細胞生長的過程中進行釋放，但是莢膜多糖的生物合成受生長條件和環(huán)境條件嚴格調(diào)控[12]。重構(gòu)微生物代謝路徑可能會導致細胞生長延滯以及中間代謝物積累，進而減弱目標產(chǎn)物的生物合成[26-27]。 因此，需要對代謝路徑上關(guān)鍵基因的表達進行優(yōu)化。 為了解決上述問題，一些路徑優(yōu)化的代謝工程策略也應運而生。本研究通過控制RBS 序列調(diào)控融合蛋白的起始翻譯速率，從而控制融合蛋白的表達水平。 除RBS 調(diào)控策略外，還有一些常用于路徑優(yōu)化的方法：啟動子工程，通過構(gòu)建廣泛的啟動子庫精細化調(diào)控基因的表達，替換啟動子提高限速步驟酶的表達[28-29]； 蛋白質(zhì)工程， 包括采用易錯PCR、 點突變和交叉延伸技術(shù)改變底物結(jié)合口袋和蛋白編碼序列的方式實現(xiàn)酶活力的提高[30]。

3結(jié) 語

作者利用代謝工程策略構(gòu)建了工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS，確定了最優(yōu)誘導劑溫度、誘導劑濃度分別為37 ℃和0.4 mmol/L，此時搖瓶水平果糖軟骨素產(chǎn)量達到了340.25 mg/L。在最優(yōu)條件下，5-L發(fā)酵罐采用DO-stat 補料策略， 果糖軟骨素的產(chǎn)量達到了3.99 g/L, 較原始菌株提高了108.9%， 為工業(yè)化生產(chǎn)果糖軟骨素奠定了基礎(chǔ)。 在后續(xù)的研究中，我們計劃同時強化軟骨素前體合成路徑，并且采用模塊路徑工程策略組合優(yōu)化前體合成路徑和聚合路徑關(guān)鍵酶的表達。