周文錦， 屈躍寬， 張 ?， 林 洪， 隋建新

（中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島266003）

魚糜制品是我國淡水魚加工的一個重要的方向，而凝膠劣化是當今影響魚糜制品質量的主要因素之一[1-3]。 最早日本學者研究發(fā)現(xiàn)[4]，魚類肌肉組織中的肌原結合型絲氨酸蛋白酶 （myofibril-bound serine proteinase，MBSP）是魚糜制品在50～65 ℃下長時間加熱而引起凝膠強度下降的主要原因。 MBSP 在一定的溫度條件下可降解肌原纖維中的肌球蛋白重鏈，同時對α-輔肌動蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白產(chǎn)生降解現(xiàn)象。 由于MBSP 廣泛存在與魚類肌肉組織中，魚糜生產(chǎn)過程中經(jīng)漂洗也無法去除，嚴重制約了魚糜制品行業(yè)的發(fā)展，目前針對MBSP 抑制的研究主要分兩類：1）針對MBSP 所在絲氨酸蛋白酶家族的抑制：如卵清蛋白[5]、動物血漿蛋白[6]、馬鈴薯淀粉[7]、豆類胰蛋白酶抑制劑[8]等均能顯著抑制絲氨酸蛋白酶活性，但由于其成本高、影響魚糜制品顏色和風味，不利于人體消化吸收等缺陷限制了其在實際生產(chǎn)中的應用；2）針對MBSP 特異性抑制劑：此類抑制劑研究較少， 主要是魚體內的內源性葡萄糖-6-磷酸異構酶（GPI）對MBSP 的抑制作用[9-11]，這些GPI 只對同類魚的MBSP 具有抑制作用，不具備廣譜特異性。 由于MBSP 抑制劑的匱乏，現(xiàn)階段魚糜生產(chǎn)大都采用添加谷氨酰胺轉氨（TG）酶[12]的方式提高魚糜制品的凝膠強度， 但TG 酶催化作用對加工條件要求較高，還需要添加非肌肉蛋白共同作用以提高效果，影響了魚糜本身屬性[13]。因此研究開發(fā)安全、 高效， 可以在加工過程直接作用于MBSP的新型廣譜特異性抑制劑，實現(xiàn)對魚糜制品凝膠劣化的控制，對整個魚糜制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的推動作用。

單域抗體（single-domain antibody，sdAbs）是近年來通過基因工程技術，從駱駝科動物和軟骨魚類血清中，克隆獲得的僅保留重鏈可變區(qū)且仍具有抗原結合活性的新型抗體[14]。 單域抗體的制備不同于傳統(tǒng)抗體，存在單域抗體文本庫情況下，通過噬菌體展示技術[15](phage display technology）淘選特異性噬菌粒，通過基因工程對特異性噬菌粒插入的基因進行克隆表達，從而獲得特異性抗體分子。 與傳統(tǒng)抗體相比，除了能與抗原特異性識別外[16-17]，單域抗體最大的優(yōu)點在于其與抗原物質特異性結合后可直接抑制抗原活性。 根據(jù)以上特性，單域抗體用于致病菌的抑制、毒素的中和，蛋白酶活性的抑制等方面已有報道并展現(xiàn)出良好的應用前景。Dolk 等在洗發(fā)香波中加入抗糠秕馬拉色氏霉菌特異性單域抗體可有效治療由糠秕馬拉色氏霉菌引起的皮下感染[18]；Hmila 和Anderson 等篩選出針對蓖麻毒素、肉毒梭菌神經(jīng)毒素的單域抗體后，不僅可以用于檢測還可以用于中和毒素[19]；Koch-Nolte F 等從駝源抗體庫中淘選得到針對毒素相關胞外酶ART2.2 特異性單域抗體， 能在體內直接抑制ART2.2 細胞毒素與酶活性[20]。

根據(jù)單域抗體的以上特性，本文作者旨在建立一個抗MBSP 天然單域抗體文本庫，借助噬菌體展示技術，通過MBSP 從文本庫中淘選得到特異性噬菌粒， 為下一步獲得抗MBSP 單域抗體奠定基礎，以此抑制或消除MBSP 的活性，解決現(xiàn)有魚糜制品凝膠劣化的問題。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、 噬菌粒 pHEN2 噬菌粒載體、E.coli TG1、E.coli BL21 (DE3）、pET-28a 質粒均由實驗室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 JY88-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Tanon-4200SF凝膠成像及分析系統(tǒng)， 上海天能公司產(chǎn)品；Power Wave XS 酶標儀，美國Biotek 公司產(chǎn)品；HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱公司產(chǎn)品，太倉市華美生化儀器廠制造。

限制性內切酶 （Nde I、Xho I、Nco I 和Not I）：NEB 公司產(chǎn)品；QIAGEN 柱式膠回收純化試劑盒：QIAGEN 公司產(chǎn)品；兔源抗組氨酸多克隆抗體，HRP標記的山羊抗兔IgG：生工生物工程(上海）股份有限公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶：TaKaRa公司產(chǎn)品；卡那霉素、氨芐霉素、異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（簡稱IPTG）、咪唑，北京索萊寶生物技術有限公司產(chǎn)品。 其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

自配試劑：2xYT/A100/G2： 含有100 μg/mL 氨芐青霉素和質量分數(shù)2%葡萄糖的2xYT 培養(yǎng)基；LB/K30/C34： 含有30 μg/mL 卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB 培養(yǎng)基；2xYT/A100/G1：含有100 μg/mL氨芐青霉素和質量分數(shù)1%葡萄糖的2xYT 培養(yǎng)基；2xYT/A100/K50： 含有100 μg/mL 氨芐青霉素和50 μg/mL 卡 那 霉 素 的2xYT 培 養(yǎng) 基；2xYT/A100/K50/G0.1：含有100 μg/mL 氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素， 質量分數(shù)0.1%葡萄糖的2xYT 培養(yǎng)基；Binding buffer：8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH 8.0；Elut ion buffer：8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，20/50/500 mmol/L Imidazole，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 MBSP 表達載體的構建 魚體肌肉中的MBSP 與肌原纖維結合緊密且含量低， 直接提取困難，相關研究大都采用重組表達的MBSP[21]，本實驗根據(jù)Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中白鰱魚MBSP 的基因序列（核苷酸序列號為EU661606）預測其理論相對分子質量為2.7×104，并以此為模版設計引物（見表1），PCR 擴增目的基因。

將MBSP 目的基因與載體質粒pET-28a 用限制性內切酶Nde I 和Xho I 雙酶切， 純化雙酶切產(chǎn)物，通過T4 連接酶16 ℃過夜連接，利用熱擊法將重組質粒導入Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，在LB/K30/ C43 固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆單菌落，提取質粒，酶切并測序鑒定。

1.2.2 融合蛋白的誘導表達以及純化 將鑒定正確的陽性單克隆菌株接種于LB/K30/C34 液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)， 取100 μL 培養(yǎng)液接種到10 mL 的LB/K30/C34 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG 分別在20 ℃過夜和37 ℃下4 h 培養(yǎng)誘導，同時以未加IPTG 的作為陰性對照。

離心收集誘導表達的菌體， 用500 μL PBS（pH 7.4）緩沖液懸浮，超聲破碎6 min（超聲0.5 s間隔1.5 s），離心收集上清液和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液 （8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 8.0） 溶解，12% SDS-PAGE電泳鑒定表達效果，以此確定最佳的誘導條件。

表1 MBSP 基因擴增所需引物Table 1 Primers of target gene

按照上述確定的最佳條件大量表達重組菌pET 28a-MBSP， 將得到的粗蛋白液進行純化。 取5 mL Ni-IDA 裝柱， 用Binding buffer 清洗平衡柱子，將粗蛋白液過0.22 μm 膜后上柱，收集流出液。用Binding buffer 清洗未結合組分，收集流出液。 用不同濃度的Elution buffer 洗脫，收集流出液。 將收集的流出液進行12%SDS-PAGE 鑒定，確定最佳洗脫條件。將純化后的蛋白液在含有質量分數(shù)0.1% SKL的PBS（pH 7.4）中4 ℃透析16 h，再在PBS（pH 7.4）中透析4 h，離心取上清，測定其濃度，經(jīng)12%SDS-PAGE和Western blot 鑒定后-80 ℃保存。

1.2.3 鯊魚免疫與免疫應答分析 稱取200 μg MBSP 溶解于0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，與等量的弗氏完全佐劑充分混合后，于成年鉸口鯊魚側鰭處皮下散點注射，每隔2 周更換弗氏不完全佐劑以同樣劑量加強免疫1 次，總共加強免疫3 次，取免疫后鯊魚血漿進行間接ELISA 分析其對MBSP 的免疫應答情況。

1.2.4 單域抗體文本庫的構建與鑒定 鯊魚免疫應答成功后，提取外周血液淋巴細胞用TRIzol 法提取RNA，逆轉錄成第一鏈cDNA，根據(jù)引物（表2）擴增鯊魚新抗原受體 （new or nurse shark antigen receptor，NAR）可變區(qū)片段，回收純化目的片段；將VNAR 片段與載體pHEN2 用Nco I 和Not I 雙酶切，經(jīng)T4 連接酶構建重組噬菌粒，利用電擊法將重組噬菌粒pHEN2-VNAR 電轉入新鮮制備的感受態(tài)大腸桿菌TG1， 梯度稀釋后涂步到2xYT/A100/G2固體培養(yǎng)基，計算庫容量，隨機挑取30 個單菌落進行菌落PCR 鑒定。 刮取培養(yǎng)基上菌落，懸浮于有質量分數(shù)15%甘油的2xYT 液體培養(yǎng)基中， 分裝-80 ℃保存。

表2 抗體可變區(qū)引物Table 2 Primers of target gene

1.2.5 噬菌體展示技術淘選針對MBSP 的特異性噬菌 粒噬菌體展示過程： 將轉化菌液接種至2xYT/A100/G2 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入M13K07 輔助噬菌體。 37 ℃靜置水浴30 min，離心去上清液，用2xYT/A100/K50 液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。離心取上清液，按照4∶1 體積比例加入PEG/NaCl 溶液冰浴至少1 h，離心去上清液并用無菌PBS（pH 7.4）重懸噬菌體沉淀，再次離心去除細菌碎片沉淀，所得上清即得原始噬菌粒文庫。

淘選過程： 添加4 mL 的MBSP （PBS 稀釋至100 μg/mL）到免疫管中，4 ℃包被過夜。 PBST 洗管后， 用5 mL 含3 g/dL 脫脂奶粉的PBS （MPBS）封閉，37 ℃孵育2 h。 PBST 洗管后， 加入3 mL 的MPBS 和1 mL 原始噬菌粒文本庫， 旋轉振蕩1 h，靜置1 h。 棄掉噬菌體文庫，PBST 洗管。 用1 mL 的三乙胺（100 mmol/L） 洗脫結合在免疫管上的噬菌粒，并加入0.5 mL 的Tris-HCl（1 mol/L，pH 7.4）中和洗脫液。再加入250 μL 的Tris-HCl（1 mol/L，pH 7.4）溶液于免疫管中，沖洗離心管壁中殘留的噬菌體， 合并2 次洗脫噬菌粒溶液， 加入甘油-80 ℃保存。 取750 μL 第1 次洗脫下噬菌粒溶液感染15 mL的TG1 菌液，37 ℃水浴30 min。 取100 μL 梯度稀釋后，涂布于2×YT/A100/G2 固體培養(yǎng)基，用于計算滴度。 剩下感染液離心棄上清液，用500 μL 的2×YT 液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，涂布于2×YT/A100/G2 固體培養(yǎng)基上，30 ℃過夜培養(yǎng)。

過夜生長后， 向平板中加入5 mL 的2×YT/A100/G2 液體培養(yǎng)基，刮取細菌菌落。 取100 μL 菌液接種于50 mL 的2×TY/A100/G2 液體培養(yǎng)基中，剩余菌液加入甘油-80 ℃保存。 將培養(yǎng)液按照上述噬菌體展示過程操作，得到的噬菌粒溶液即為第1 次淘選噬菌粒文庫。 取1 mL 噬菌粒溶液用于下一輪淘選，剩下的加入甘油-80 ℃保存。隨后降低包被抗原質量濃度為10、1 μg/mL，分別重復上述淘選過程與噬菌體展示過程，總共進行3 輪淘選。

1.2.6 特異性噬菌粒的多克隆ELISA 鑒定 每孔加100 μL 的MBSP （用PBS 稀釋至10 μg/mL）包被96 孔酶標板，4 ℃過夜。 棄包被液，PBST 洗板3次，每孔加入200 μL MPBS，37 ℃封閉2 h。棄封閉液，PBST 洗板3 次，加入100 μL/ 孔MPBS 和10 μL/孔3 輪淘選的噬菌粒文庫，37 ℃孵育1 h。PBST 洗板3次，每孔加入100 μL HRP/ anti-M13(用PBS 按1∶5000 稀釋），37 ℃孵育1 h。 PBST 洗板3 次，按100 μL/孔加入TMB 顯色液，37 ℃孵育10 min 顯色，按50 μL/孔加入2 mol/L 硫酸終止反應，酶標儀在450 nm 下讀值。 以原始噬菌粒文庫作為陰性對照。

1.2.7 特異性噬菌粒的單克隆ELISA 鑒定 單克隆噬菌粒擴增：選擇3 輪滴度測定平板，隨機挑取96 個單菌落至96 孔細胞培養(yǎng)板， 加入200 μL 2xYT/A100/G2 液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。 隔日從培養(yǎng)板每孔取10 μL 菌液轉移到新的96 孔細菌培養(yǎng)板對應位置，加入200 μL 的2xYT/A100/G2液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2 h。 加入M13K07 輔助噬菌體37 ℃振蕩培養(yǎng)至少1 h，離心去上清液，每孔用200 μL 2xYT/A100/K50/G0.1 液體培養(yǎng)基重懸菌液，30 ℃培養(yǎng)過夜。 隔日離心，取上清液。

ELISA 鑒定：每孔加100 μL 的MBSP（用PBS稀釋至10 μg/mL） 包被96 孔酶標板，4 ℃過夜。PBST 洗板3 次，每孔加入200 μL MPBS，37 ℃封閉2 h。 PBST 洗板3 次，加入50 μL 的MPBS 和50 μL培養(yǎng)板離心后上清液，37 ℃孵育1 h。 隨后步驟與1.2.6 中ELISA 步驟一致，以OD450值是陰性對照的2 倍為標準，挑選陽性噬菌粒。

2結果與分析

2.1 MBSP 最佳誘導條件的確定

經(jīng)20 ℃和37 ℃誘導表達后，20 ℃誘導條件下沒有出現(xiàn)目標蛋白質條帶，37 ℃誘導條件下的上清液與沉淀均在2.7×104處均有明顯的蛋白質條帶，沉淀中的表達量顯然多于上清液中，說明目的蛋白質主要以包涵體形式在沉淀中，見圖1。為了得到大量的MBSP，選擇37 ℃培養(yǎng)4 h 作為誘導表達的條件。

2.2 MBSP 的純化與鑒定

表達的MBSP 帶有his（組氨酸）標簽，通過鎳離子金屬親和層析柱時能與填料結合，再用高濃度的咪唑洗脫下來。 收集洗脫下的溶液進行SDSPAGE 分析（圖2）。由圖可見，當咪唑的濃度為500 mmol/L 時，有大量的目的蛋白被洗脫。 將純化后的MBSP 進行SDS-PAGE 及Western Blot （抗his 標簽的兔抗及HRP 標記的羊抗兔抗體）的檢測，如圖3 所見，得到MBSP 蛋白質。

圖2 鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE 分析Fig. 2 Purification of recombinant endolysin by Ni-IDA

圖3 純化后MBSP 蛋白電泳及免疫印跡圖Fig. 3 SDS-PAGE and western blot of MBSP

2.3 鯊魚的免疫應答分析

已有研究證明軟骨魚類與其他下頜脊椎動物有共同的祖先，它們具有包括免疫球蛋白（Ig），T 細胞受體和MHC 的免疫系統(tǒng)?？乖庖呓g口鯊后，會在第一時間產(chǎn)生體液應答，對應的淋巴B 細胞反應產(chǎn)生針對抗原的IgNAR[22]。 如圖4 所示，隨著鉸口鯊的3 次免疫進行， 血漿對MBSP 存在結合反應。這證明MBSP 免疫鉸口鯊后，于其體內產(chǎn)生了特異性的抗體。

圖4 鯊魚血清結合反應分析Fig. 4 Analysis of serum binding

2.4 單域抗體文本庫的構建與鑒定

噬菌體展示技術常被用于抗體工程中，在噬菌體展示文庫中對特定抗原的特異性抗體的篩選。IgNAR 的可變區(qū)由于體細胞高突變而高度多樣化[23-24]，因此已有研究利用鉸口鯊、 須鯊（Orectolobusmaculatus）、白斑角鯊（Squalus acanthias）和大星鯊（Mustelus canis）的IgNAR 的可變區(qū)，成功構建噬菌體展示文庫[25]。 單域抗體文庫質量的好壞決定著噬菌體展示能否順利進行，其質量好壞主要取決于文庫庫容大小、插入率與文庫的多樣性。 通過PCR 后電泳結果（圖5）顯示，30 個單菌落擴增后均得到與插入基因片段大小一致，約400 bp 的產(chǎn)物，說明文本庫的正確插入率為100%。 經(jīng)計算本實驗所制備的文庫的庫容達到4.7×107，達到建庫要求（一般為107）。雖然沒有深入探究其多樣性，但是根據(jù)以往研究顯示，相對于人工合成庫，免疫文庫多樣性完全能夠保障淘選出多樣性的抗體，綜上所述，得到了一個高質量的針對MBSP 的單域抗體文本庫，為接下來的淘選提供了保障。 不僅如此， 鯊魚的VNAR區(qū)和駱駝重鏈可變區(qū)片段（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH） 雖然都來源于天然存在的重鏈抗體，但不同于駱駝VHH 結構域，VNAR 結構域與輕鏈和T 細胞受體比其他的VH結構域更具有相似性和抗原結合能力[26-29]。

2.5 特異性噬菌粒的多克隆ELISA 鑒定

淘選過程是從所制噬菌體展示文庫中，固定抗原結合特異性噬菌粒，從而富集特異性單域抗體基因的過程。 為了得到特異性高的噬菌粒，淘選一般進行3 輪，每輪淘選可以純化約4～10 倍[30]。 淘選過程決定著得到的抗體基因的特異性高低，本文淘選過程采用免疫管代替常用96 孔酶標板， 擴大了淘選的規(guī)模，提高了特異性噬菌粒結合的可能性。 間接ELISA 結果顯示（圖6）相同抗原濃度下，第1 輪淘選后OD450值與陰性對照沒有顯著差異， 說明噬菌粒結合能力較弱， 但2、3 次淘選后，OD450值明顯高于陰性對照， 且3 輪OD450值呈遞增趨勢， 說明MBSP 結合上的特異性噬菌粒逐漸增多。 這與Jinny L. Liu 等人[31]研究相同，證明伴隨淘選過程中抗原濃度的降低，淘選得到的特異性噬菌粒對抗原的結合逐漸增強。

圖5 菌落PCR 鑒定初級文庫Fig. 5 Colony PCR analyses of randomly picked colonies from NAL

圖6 Phage-ELISA 測定噬菌體Fig. 6 Phage-ELISA for amplified phage library from each round of panning

2.6 特異性噬菌粒的單克隆ELISA 鑒定

將MBSP 作為抗原，用間接ELISA 驗證96 個噬菌粒的特異性。 以OD450值＞陰性對照2 倍（0.4）作為標準，挑選特異性高的噬菌粒，即與抗原結合能力最強的噬菌粒。 由圖7 可見，96 個噬菌粒中有31 個OD450值＞0.4，陽性率為32.3%，即有31 個對MBSP 有高結合能力的特異性噬菌粒， 為后續(xù)分離特異性高的噬菌粒中VNAR 基因，進行表達與純化，得到針對MBSP 的特異性單域抗體奠定了基礎。

圖7 Phage-ELISA 測定噬菌體單克隆子Fig. 7 Phage-ELISA for phage clones randomly picked from the panning

3結 語

作者以MBSP 作為抗原免疫鉸口鯊，經(jīng)驗證免疫后血漿與抗原具有良好結合反應。 通過PCR 技術從鉸口鯊血液淋巴B 細胞中獲得單域抗體基因，構建單域抗體文本庫。 該免疫文本庫通過實驗的驗證，大小、插入率及多樣性良好。 借助噬菌體展示技術，固定MBSP 從單域抗體文本庫中淘選出能與其特異性結合的噬菌粒， 為后續(xù)快速獲得特異性抗MBSP 單域抗體奠定技術與物質基礎。 有效擴展了免疫技術的應用范圍，又為食品中酶抑制劑的研究開發(fā)提供了新思路和新方法。