楊衛(wèi)，許曉云，監(jiān)士寧，王海洋2，吳欣

(1.保定市第一中心醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)常見疾病，近些年中國的哮喘患病率正在迅速上升[1]，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。支氣管哮喘是一種以氣道反應(yīng)性增高和可逆性氣流受限為特征的氣道慢性炎性疾病，多種炎癥細(xì)胞參與了炎癥過程。支氣管哮喘患者的氣道上皮完整性被破壞，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，同時伴有黏液腺增生、平滑肌增殖、氣道周圍新生血管增多[2]，從而導(dǎo)致氣道管壁增厚和管腔變窄，最終出現(xiàn)不完全可逆性的氣流受限。目前認(rèn)為，氣道重塑有可能是難治性哮喘的重要原因之一，因此近些年人們對氣道重塑的關(guān)注度也越來越高。目前對氣道重塑的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，臨床中尚缺乏防治哮喘氣道重塑的有效措施。進(jìn)一步研究氣道重塑的可能機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，是需要進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。研究哮喘大鼠早期吸入布地奈德后肺功能、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的變化，同時研究了骨橋蛋白與肺功能、氣道重塑的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 制備哮喘動物模型

清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量130～170 g，隨機(jī)分成模型組、對照組和治療組，每組20只。3組大鼠分別于第1天、第7天向腹膜腔注射含卵清蛋白100 mg、氫氧化鋁100 mg混懸液2 mL，百日咳疫苗1 mL(含50億菌株)進(jìn)行致敏。第15天后將模型組、治療組實(shí)驗(yàn)動物置于20 cm×30 cm×40 cm不完全密閉的自制熏箱中霧化吸入卵清蛋白，隔日1次，卵清蛋白濃度由1%逐漸遞增到1.5%、2.0%、2.5%、3.0%(每一種濃度霧化4次)。對照組全程應(yīng)用0.9%生理鹽水霧化吸入。治療組每日應(yīng)用布地奈德溶液(0.5 g/L)霧化吸入20 min治療，每天2次，對照組和模型組同時吸入等量的生理鹽水。

1.2 肺功能檢測

最后一次霧化吸入治療24 h后進(jìn)行肺功能檢查。使用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)腹膜腔注射，麻醉滿意后行頸正中切口，充分暴露氣管，切開氣管，連接動物呼吸機(jī)。建立頸靜脈液路，檢測基本氣道阻力。經(jīng)頸靜脈依次注入生理鹽水和乙酰膽堿(乙酰膽堿劑量依次為6.25、12.50、25.00、50.00 μg/kg)，檢測注藥后曲線下面積的變化，每次注藥間隔5 min。

1.3 支氣管肺泡灌洗液收集

肺功能檢測完畢后，采用4 ℃無菌生理鹽水2 mL灌洗左肺：灌洗時將生理鹽水經(jīng)氣管插管緩慢注入，輕輕按摩胸壁，保留30 s后緩慢抽出，反復(fù)3次，收集全部支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，經(jīng)兩層紗布過濾，離心(1 200 r/min，4 ℃，10 min)，吸取上清，分裝，-80 ℃冰箱保存。

1.4 病理

留取右肺上葉，經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀測氣道上皮、氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.5 肺泡灌洗液骨橋蛋白測定

步驟按骨橋蛋白ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 免疫組化法檢測氣道α-SMA

切片常規(guī)脫蠟至水；0.01 mol/L PBS清洗3次，0.3%甲醇-過氧化氫室溫孵育20 min；蒸餾水清洗3次，每次5 min；0.01 mol/L構(gòu)櫞酸緩沖液(pH6.0)微波爐內(nèi)修復(fù)，98 ℃維持20 min，冷卻至室溫；10%山羊血清，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；濾紙吸去多余血清，分別加入鼠抗大鼠IgG單克隆抗體；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加生物素化二抗(山羊抗鼠)工作液，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；DAB顯色2.5 min；自來水沖洗，終止顯色；梯度乙醇脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明；中性樹膠封固。陰性對照用PBS替代一抗，步驟同上。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺功能檢查結(jié)果

與對照組比較，模型組與治療組氣道阻力升高(P<0.05)，治療組氣道阻力較模型組減低(P<0.05)；靜脈注入生理鹽水和6.25 μg/kg乙酰膽堿后氣道阻力變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。增加乙酰膽堿濃度后3組實(shí)驗(yàn)動物均出現(xiàn)氣道阻力增加，提示氣道反應(yīng)性增高，其中模型組最為明顯(表1)，3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 肺功能檢測結(jié)果

曲線下面積為比值，沒有單位。

2.2 肺組織HE染色

與對照組比較，模型組氣道黏膜皺襞增多、平滑肌增厚，氣道周圍炎癥細(xì)胞明顯增多，治療組同樣存在上述情況，程度較模型組輕(圖1)。

圖1 肺組織HE染色( HE×200倍)

2.3 氣道α-SMA免疫組化結(jié)果

模型組和治療組肺組織α-SMA光度值較對照組明顯增高(P<0.05)，治療組表達(dá)低于模型組(P<0.05)(圖2、圖3和表2)。

圖2 α-SMA表達(dá)(免疫組化×400倍)

圖3 氣道α-SMA 表達(dá)

2.4 支氣管肺泡灌洗液骨橋蛋白檢測結(jié)果

模型組和治療組大鼠支氣管肺泡灌洗液骨橋蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.05)，治療組較模型組表達(dá)降低(P<0.05)(表2、圖4)。

表2 支氣管肺泡灌洗液骨橋蛋白和氣道α-SMA檢測結(jié)果

組別n骨橋蛋白/(pg/mL-1)α-SMA 對照組20155.32±36.410.14±0.04 模型組20386.43±85.210.38±0.11 治療組20267.33±64.210.21±0.08F38.7931.06 P<0.01<0.01

圖4 骨橋蛋白表達(dá)

3 相關(guān)性分析

3.1 對骨橋蛋白和氣道α-SMA進(jìn)行相關(guān)性分析

對骨橋蛋白和氣道α-SMA進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，骨橋蛋白和α-SMA之間呈正相關(guān)(r=0.71,P<0.01)(圖5)。

3.2 對骨橋蛋白和氣道基本阻力進(jìn)行相關(guān)性分析

對骨橋蛋白和氣道基本阻力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，骨橋蛋白和氣道阻力之間呈正相關(guān)(r=0.90,P<0.01)(圖6)。

圖5 骨橋蛋白和氣道α-SMA相關(guān)性

圖6 骨橋蛋白和氣道基本阻力相關(guān)性

4 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道高反應(yīng)性是支氣管哮喘的重要臨床特征之一，因此肺功能及氣道反應(yīng)性檢測是診斷支氣管哮喘、評估病情的重要手段。研究中，首先對3組實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行了肺功能檢測，檢測結(jié)果顯示哮喘模型組氣道基本阻力較對照組升高，靜脈注入乙酰膽堿后哮喘模型組氣道阻力變化幅度較對照組明顯增高，提示氣道反應(yīng)性增高，因此哮喘動物模型制備是成功的。治療組氣道基本阻力較模型組減低，在靜脈注射乙酰膽堿后氣道阻力變化幅度低于模型組，提示霧化吸入布地奈德可以降低氣道阻力，改善肺功能。

氣道重塑是氣道對損傷性刺激的修復(fù)反應(yīng)，也是支氣管哮喘的重要特征之一。氣道重塑是指支氣管哮喘氣道上皮受損后出現(xiàn)的管壁結(jié)構(gòu)性改變，包括上皮細(xì)胞增生、上皮下纖維化、杯狀細(xì)胞化生、平滑肌細(xì)胞增生與肥大、基質(zhì)蛋白沉積等。氣道重塑的結(jié)果往往是平滑肌增殖、肥大，氣道膠原沉積，最后導(dǎo)致氣道管壁增厚、管腔狹窄。氣道重塑后的支氣管結(jié)構(gòu)和功能與正常的氣道結(jié)構(gòu)、功能有所不同，因此氣道重塑有可能是哮喘反復(fù)發(fā)作和頑固性哮喘的重要病理基礎(chǔ)，其程度與哮喘患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。

骨橋蛋白是一種分泌性糖基化磷蛋白，又稱為特異性成骨細(xì)胞因子-2[3]，各種組織和體液中均有存在，正常肺組織中也有少量骨橋蛋白表達(dá)。在疾病狀態(tài)下骨橋蛋白可以在支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等多處表達(dá)。目前認(rèn)為骨橋蛋白與支氣管哮喘密切相關(guān)，研究[4]發(fā)現(xiàn)，哮喘動物模型中嗜酸性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白增加，骨橋蛋白能夠促進(jìn)炎性細(xì)胞向氣道內(nèi)遷移、參與氣道炎癥以及氣道重塑等過程。骨橋蛋白還具有促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞趨化的作用，研究[5]顯示，哮喘患者血中的骨橋蛋白明顯升高，與嗜酸性粒細(xì)胞具有一致性，并且哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中骨橋蛋白也明顯升高[6]，其水平與嗜酸性粒細(xì)胞水平呈正相關(guān)。同時，骨橋蛋白還能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞向氣道炎癥部位遷移，促進(jìn)氣道平滑肌的增生、加速氣道重塑[7]，因此骨橋蛋白與氣道平滑肌纖維化、氣道重塑關(guān)系密切[8]。本研究顯示，骨橋蛋白增高程度與哮喘氣道反應(yīng)性呈正相關(guān)，提示骨橋蛋白與哮喘肺功能結(jié)果密切相關(guān)，有可能參與肺功能調(diào)節(jié)。同時研究顯示，骨橋蛋白可以刺激成纖維細(xì)胞激活、氣道平滑肌增殖，其表達(dá)情況與氣道平滑肌面積和膠原沉積情況明顯相關(guān)。有學(xué)者[9-10]發(fā)現(xiàn)，敲除骨橋蛋白基因的哮喘小鼠比模型組小鼠氣道高反應(yīng)性減低、纖維化減少、膠原沉積減輕、氣道平滑肌面積減少，因此骨橋蛋白在哮喘氣道重塑中起著重要作用，細(xì)胞因子骨橋蛋白的過度表達(dá)能夠加速氣道重塑。

肌動蛋白(actin)是平滑肌的重要蛋白成分之一，也是細(xì)胞骨架微絲的基本成分， 具有構(gòu)成細(xì)胞支架、維持細(xì)胞形狀、參與細(xì)胞運(yùn)動的作用。 肌動蛋白包括 α 、β 、 γ 三種亞型，其中α所占比例最高。α-SMA可以分為收縮型和增殖型兩種表型，其中收縮型多見于成熟的血管平滑肌細(xì)胞，增殖型多見于發(fā)育早期或病理過程中的血管平滑肌細(xì)胞。α-SMA能夠反映平滑肌細(xì)胞的數(shù)量和平滑肌收縮能力的大小，因此α-SMA的表達(dá)增多提示氣道反應(yīng)性增高、氣道重塑程度加重。 正常大鼠氣道周圍有少量 α-SMA表達(dá)，哮喘大鼠模型制備過程中，1周后肺組織中α-SMA mRNA表達(dá)即可增加，2周α-SMA mRNA增加將更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠氣道周圍α-SMA表達(dá)明顯增多，并且與骨橋蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示骨橋蛋白與α-SMA的增殖密切相關(guān)，通過吸入布地奈德治療后骨橋蛋白和α-SMA的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度下降，提示吸入布地奈德治療可以下調(diào)骨橋蛋白和α-SMA的表達(dá)，抑制氣道重塑。

與全身用糖皮質(zhì)激素相比，吸入性糖皮質(zhì)激素具有不良反應(yīng)少、用量小的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效減輕氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥反應(yīng)，但是吸入糖皮質(zhì)激素是否能夠有效抑制氣道重塑目前相關(guān)研究并不多。研究[11]認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素可以減少機(jī)體骨橋蛋白 mRNA 的表達(dá)水平，這與本研究結(jié)果相符合。故本課題組認(rèn)為吸入布地奈德能夠抑制骨橋蛋白和α-SMA的表達(dá)，其機(jī)制有可能與吸入布地奈德后氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕，骨橋蛋白和α-SMA產(chǎn)生減少等因素有關(guān)，其中多條信號傳導(dǎo)途徑參與了這個過程，上述研究為早期吸入布地奈德治療哮喘氣道重塑提供了理論基礎(chǔ)。而且，吸入布地奈德對氣道重塑的影響與哮喘動物模型肺功能是相符合的，但是深層次的機(jī)制還需要后續(xù)的研究進(jìn)一步了解。