[摘 要] 冬蟲(chóng)夏草是蝙蝠蛾幼蟲(chóng)和寄生真菌中國(guó)被毛孢的復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥中的瀕危物種。關(guān)于冬蟲(chóng)夏草及其無(wú)性型中國(guó)被毛孢已有很多研究報(bào)道，然而對(duì)于蝙蝠蛾幼蟲(chóng)人工接種中國(guó)被毛孢和冬蟲(chóng)夏草子囊孢子的侵染效果對(duì)比卻鮮有報(bào)道。基于此，本研究采用中國(guó)被毛孢菌絲體和冬蟲(chóng)夏草子囊孢子，分別在室內(nèi)人工侵染養(yǎng)殖蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，并對(duì)侵染效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，以中國(guó)被毛孢菌絲體懸液為菌種，接種成功率較低。

[關(guān)鍵詞] 冬蟲(chóng)夏草;中國(guó)被毛孢;子囊孢子;蝙蝠蛾幼蟲(chóng)

[中圖分類號(hào)] S567.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-7909（2020）07-105-2

冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)傳統(tǒng)的特色中藥材，是麥角菌科冬蟲(chóng)夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)子座上的復(fù)合物。冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)在低溫缺氧的高山草甸上，且對(duì)環(huán)境要求非常嚴(yán)格，同時(shí)人們對(duì)其的掠奪式采挖導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境破壞，因此人們?cè)噲D通過(guò)人工來(lái)培育冬蟲(chóng)夏草，充分發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。

目前，人們尚不清楚冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的機(jī)制。楊大榮等指出，冬蟲(chóng)夏草菌主要是通過(guò)子囊孢子黏附幼蟲(chóng)新嫩表皮的方式進(jìn)入其體腔從而形成冬蟲(chóng)夏草[1]。本試驗(yàn)采用冬蟲(chóng)夏草的有性型子囊孢子和無(wú)性型中國(guó)被毛孢菌絲體這兩種接種體分別對(duì)寄主幼蟲(chóng)進(jìn)行侵染比較，為冬蟲(chóng)夏草安全性研究方面以及人工培育子實(shí)體方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蟲(chóng)種。3齡蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，采自四川省德陽(yáng)縣蟲(chóng)草基地，室內(nèi)人工短期飼養(yǎng)。

1.1.2 菌種。一是天然有性型菌種。采自青海省玉樹(shù)藏族自治州的天然冬蟲(chóng)夏草經(jīng)人工誘導(dǎo)其彈射、收集得到具有侵染能力的冬蟲(chóng)夏草子囊孢子。二是固體培養(yǎng)無(wú)性型菌種。中國(guó)被毛孢（Hirsutella.sinensis）寄主是蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，菌種采自青海青沙山。

1.1.3 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基成分包括蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、麥芽糖10 g/L、瓊脂20 g/L、無(wú)水硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、檸檬酸三銨0.4 g/L、南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的復(fù)合維生素B片4片/L，蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蝙蝠蛾幼蟲(chóng)飼養(yǎng)。在已滅菌的9 cm×12 cm養(yǎng)蟲(chóng)盒里鋪上適宜幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的高山草甸土，并種上幼蟲(chóng)取食的植物珠芽蓼塊根（所有的土壤以及食物都要經(jīng)過(guò)紫外照射嚴(yán)格滅菌）。待植物成活后，把蝙蝠蛾幼蟲(chóng)移入器皿內(nèi)，每個(gè)器皿飼養(yǎng)兩只幼蟲(chóng)?？諝鉂穸瓤刂圃?0%～85%，溫度控制在10～16 ℃，土壤含水量控制在40%～50%，避光飼養(yǎng)，每隔15 d換1次器皿與飼料。

1.2.2 蟲(chóng)草子囊孢子的獲取。在不同的玻璃平皿內(nèi)分別將子座膨大的新鮮蟲(chóng)草標(biāo)本的蟲(chóng)體部分用滅菌的脫脂棉進(jìn)行保濕，子座頭部懸于滅菌的載玻片上，置于16 ℃，光周期為12L∶12D的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，5～10 d后可釋放子囊孢子。

1.2.3 斜面菌種培養(yǎng)。用已滅菌的接種針挑取少量實(shí)驗(yàn)室固體斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基上，置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落呈圓形凸起，顏色由灰白色轉(zhuǎn)淺黃褐色至黃褐色時(shí)置于4 ℃冰箱備用。

1.2.4 菌絲體懸液及子囊孢子懸液的制備。用已滅菌的接種針挑取少量培養(yǎng)的中國(guó)被毛孢菌絲體，置于無(wú)菌水中并用高速分散器打散，制成菌絲液備用。收集天然冬蟲(chóng)夏草彈射在無(wú)菌載玻片上的子囊孢子，用已滅菌的涂布器將其刮入無(wú)菌水中，搖勻后備用。

1.2.5 接種培養(yǎng)

1.2.5.1 接種體。為研究冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的機(jī)制，本研究分別以菌絲體懸液、子囊孢子懸液為接種體，每次分別侵染50只蝙蝠蛾幼蟲(chóng)。

1.2.5.2 接種方式?？紤]到蝙蝠蛾幼蟲(chóng)幾天就蛻皮一次，而蛻皮可能對(duì)浸濕侵染不利，故本試驗(yàn)選擇在浸蘸接種后進(jìn)一步采取穿刺接種法并同時(shí)將菌液混入幼蟲(chóng)食物中，以增加侵染成功率。

1.2.6 接種后處理。接種后將幼蟲(chóng)放入事先編號(hào)的已滅菌的培養(yǎng)皿中，僅飼喂少量珠芽蓼，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于16 ℃避光條件下培養(yǎng)。2 d后繼續(xù)給予珠芽蓼并注意補(bǔ)充無(wú)菌水以保濕培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)入土壤中繼續(xù)飼養(yǎng)。每隔4 d檢查統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)死亡情況并加入少量珠芽蓼（珠芽蓼均要求進(jìn)行紫外照射、滅菌消毒）。

2 結(jié)果與分析

2.1 子囊孢子收集

將冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體的可孕部分橫切制片鏡檢，在顯微鏡下，可觀察到子囊細(xì)長(zhǎng)，（247.0～420.0）μm×（7.0～10.0）μm，一端或兩端略尖，直或稍彎，子囊壁薄且透明。在子囊孢子發(fā)育初期可以明顯看到每個(gè)子囊里有1～8個(gè)子囊孢子，初期的子囊孢子呈球形或橢圓形，一個(gè)接一個(gè)地緊密排列在子囊中。有些含有子囊孢子的子囊比無(wú)子囊孢子的子囊要長(zhǎng)。隨著子囊的發(fā)育，孢子逐漸伸長(zhǎng)成為長(zhǎng)橢圓形或絲狀，一個(gè)子囊中最終僅有一兩個(gè)或者是4個(gè)子囊孢子發(fā)育成熟并彈射出來(lái)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)載玻片上有灰白色細(xì)粉狀物時(shí)，用沾有無(wú)菌水的接種環(huán)黏取粉狀物制成子囊孢子懸液，境檢會(huì)看到典型的冬蟲(chóng)夏草長(zhǎng)橢圓形或絲狀子囊孢子。

2.2 菌種培養(yǎng)

中國(guó)被毛孢菌株生長(zhǎng)緩慢，在固體培養(yǎng)基上，18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)180 d，菌落呈圓形凸起，堅(jiān)硬，顏色呈灰褐色至黃褐色，且會(huì)產(chǎn)生黃褐色至暗褐色素滲入培養(yǎng)基中。

2.3 接種培養(yǎng)

2.3.1 子囊孢子懸液接種。供試幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)冬蟲(chóng)夏草的有性型子囊孢子懸浮液接種后60 d左右開(kāi)始僵化死亡，用解剖刀剖開(kāi)僵蟲(chóng)鏡檢，可見(jiàn)僵蟲(chóng)體腔內(nèi)部分布大量菌絲（菌核），保濕培養(yǎng)一段時(shí)間后，白色菌絲體逐漸布滿僵蟲(chóng)外表面。蟲(chóng)體內(nèi)部菌絲（菌核）形態(tài)較一致，菌絲多分叉，并有菌絲纏繞形成的結(jié)節(jié)（菌核）（見(jiàn)圖1B），從形態(tài)學(xué)上觀察該菌絲（菌核）與冬蟲(chóng)夏草體內(nèi)的菌絲（菌核）較相似（見(jiàn)圖1A）。

2.3.2 中國(guó)被毛孢菌絲體懸液接種。供試幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型中國(guó)被毛孢菌絲體懸浮液接種40 d左右就出現(xiàn)幼蟲(chóng)僵硬死亡，有些蟲(chóng)體表面菌絲較少，有些僵蟲(chóng)體表有較多白色菌絲，甚至出現(xiàn)綠色孢子或孢梗束，顯然后者為雜菌感染。

挑取僵蟲(chóng)組織或體表的菌絲制片，在顯微鏡下觀察。在放大10×40倍時(shí)，可看到有些僵蟲(chóng)上菌絲或組織樣品中有典型的球孢白僵菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，有些有綠僵菌或擬青霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，因此剔除這些非目標(biāo)菌感染樣品。余下的中國(guó)被毛孢無(wú)性型侵染所得的僵蟲(chóng)體內(nèi)可見(jiàn)有大量的菌絲體和菌核，形態(tài)較一致（見(jiàn)圖2B），從形態(tài)學(xué)上觀察與冬蟲(chóng)夏草較相似（見(jiàn)圖2A）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)人工收集天然冬蟲(chóng)夏草彈射的子囊孢子并將制得的子囊孢子懸液作為接種體，用于侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，最終通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在接種后60 d左右開(kāi)始形成僵蟲(chóng)，保濕培養(yǎng)一段時(shí)間后，僵蟲(chóng)外表面出現(xiàn)菌絲，用解剖刀剖開(kāi)僵蟲(chóng)，制片鏡檢可以觀察出由子囊孢子懸液侵染所得的僵蟲(chóng)體內(nèi)有大量的菌絲（菌核），形態(tài)一致，菌絲分叉有結(jié)節(jié)，從菌絲形態(tài)學(xué)上觀察與冬蟲(chóng)夏草菌絲（菌核）較相似。將制得的中國(guó)被毛孢菌絲體懸液作為接種體時(shí)，在采用同樣的接種方式進(jìn)行侵染以后40 d左右形成僵蟲(chóng)，有些蟲(chóng)體表面菌絲較少，有些雜菌感染的僵蟲(chóng)表面菌絲較多，甚至有孢梗束以及白色或其他顏色的孢子，表明以中國(guó)被毛孢菌絲體懸液為菌種接種成功率較低。給蝙蝠蛾幼蟲(chóng)人工接種中國(guó)被毛孢較易污染雜菌，如果沒(méi)有進(jìn)一步分析而將其盲目用作冬蟲(chóng)夏草的替代品，可能存在安全隱患。在進(jìn)行大規(guī)模人工培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草及其替代品的實(shí)際操作中，對(duì)于如何避免雜菌污染，從而確保其產(chǎn)品的有效性和安全性仍需要深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]楊大榮，沈發(fā)榮，楊躍雄，等.蟲(chóng)草蝠蛾生態(tài)學(xué)的研究Ⅲ.幼蟲(chóng)越冬與生理調(diào)節(jié)[J].動(dòng)物學(xué)研究，1988（s1）：43-49.

作者簡(jiǎn)介：韓曉然（1992—），女，農(nóng)學(xué)碩士，研究方向：森林保護(hù)學(xué)。