蘇 瓊 文 芳 熊桂斌 熊 欣 黃 露

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院藥劑科 武漢 430077)

檸檬酸是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸，無色晶體，常含一分子結晶水，無臭，有很強的酸味，易溶于水。檸檬酸是生理學中將脂肪、蛋白質和糖轉化為二氧化碳的過程中的重要化合物。這些化學反應是幾乎所有代謝的核心反應，并且為高等生物提供能量。檸檬酸是有機酸中第一大酸，由于物理性能、化學性能和衍生物的性能，是廣泛應用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)最重要的有機酸[1～2]。

檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸),在弱酸條件下,α-酮酸與苯肼生成相應的α-酮酸苯腙,α-酮酸苯腙在330nm處有強的吸收峰,吸光度的變化程度可反映出檸檬酸含量[3～4]。通過檸檬酸裂解酶-苯肼顯色的方法，建立了尿液中枸櫞酸的測定方法。

1 儀器與試劑

儀器：UV-2450紫外分光光度儀(日本SHIMADZU公司)，PHS-3B精密pH計(上海精科雷磁)。

試劑：檸檬酸對照品(優(yōu)級純，純度：99.8%, 國藥集團化學試劑有限公司)；檸檬酸裂解酶(Citrate Lyase from Enterobacter aerogene，美國SIGMA公司)；疊氮鈉(分析純，武漢凱博實驗儀器有限公司)，硫酸鋅(分析純,天津市博迪化工有限公司)，苯肼(分析純，上海三愛思試劑有限公司)，Bis-Tris緩沖液(Amresco公司，純度>98%)；試驗用水為雙蒸水(自制)。

2 方法

2.1 標準儲備液和內標液的配制

苯肼液(246mmol/L)：使用前取50μl苯肼母液置于離心管內，加2.0ml蒸餾水混勻配制而成。每次使用前新鮮配制。

檸檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)：取活力為0.3u/mg的檸檬酸裂解酶44.44mg，溶于1ml蒸餾水中，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆?。未使用完的裂解酶?20℃冰箱保存保持活力。

Bis-Tris(50mmol/L)緩沖液：含0.1mmol/L的硫酸鋅和0.2mmol/L疊氮鈉,用12mol/L鹽酸調節(jié)pH至6.5，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

檸檬酸母液(40 mmol/L)的配制： 精密稱取檸檬酸標準品0.4202g，定容至50ml，配制成濃度為40 mmol/L的標準液，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品處理

20μl苯肼液(246mmol/L)置于EP管內，再加入20μl經0.22μm濾膜濾過的尿液或標準液或蒸餾水，渦旋混勻，平行配制兩份，靜置15min，加入1.0mlBis-Tris緩沖液，渦旋混勻，排氣泡，一份在330nm處測定吸光度Awater，另一份加入20ul檸檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)，靜置30min，測定吸光度Asample。ΔA=Asample-Awater，尿液中枸櫞酸濃度按以下公式計算：Csample=(ΔAsample-ΔAwater)/(ΔAstd-ΔAwater)* Cstd。

3 方法學論證

3.1 標準曲線制備

精密稱取檸檬酸標準品0.4202g，定容至50ml，配制成濃度為40 mmol/L的標準液，依次稀釋成濃度為20，10，6，4，2，1 mmol/L的標液，取各濃度標液適量，空白尿液定容，配制成使加入濃度分別為4，2，1，0.6，0.4，0.2，0.1 mmol/L的尿樣標準液，按樣品處理方法進行測定，以所得吸光度的差值 (△A尿標-△A尿空)對濃度(C, mmol/L)進行線性回歸(權重為1)，得枸櫞酸尿藥標準曲線方程為Y=0.2154X+0.0066，相關系數(shù)R2為0.9953，制備方法學標準曲線。

3.2 最低檢測限(0.1mmol/L)精密度檢測

取1 mmol/L濃度標液，空白尿液定容，配制成使加入濃度為0.1mmol/L尿樣標液，按樣品處理方法進行測定，平行處理5份，測定其吸光度，計算枸櫞酸根離子濃度，測定結果批內標準差(RSD)為8.42%。

3.3 精密度試驗

取2，6，20 mmol/L濃度標液，空白尿液定容，配制成使加入枸櫞酸濃度為0.2，0.6，2mmol/L的尿樣標液，每個濃度按樣品處理方法平行處理5份，測定吸光度，連續(xù)測定3d，以此計算日內和日間變異，結果枸櫞酸離子低，中，高濃度日內相對標準差(RSD)為4.04%、5.89%、4.93%，日間相對標準差(RSD)為6.44%、5.33%、3.46%(表1)。

表1 酶裂解-苯肼顯色法測定尿中枸櫞酸日內日間精密度(n=5)

3.4 相對回收率試驗

取2，6，20 mmol/L濃度標液，空白尿液定容，配制成使加入枸櫞酸濃度為0.2，0.6，2mmol/L的尿樣標液，每個濃度按樣品處理方法平行處理5份，測定吸光度，計算其枸櫞酸根離子濃度，與理論的枸櫞酸離子濃度相比，計算相對回收率。枸櫞酸離子低、中、高3種濃度的平均相對回收率分別為103.40%、103.44%、98.78%。

3.5 穩(wěn)定性試驗

3.5.1放置穩(wěn)定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個濃度尿樣標液，分別于室溫(25℃)下放置0h，2h，4h后，按尿液樣品處理方法進行測定吸光度，計算其枸櫞酸離子濃度，考察尿液樣品在室溫下不同時間條件下的穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.2凍融穩(wěn)定性

將0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個濃度尿樣標液放入-70℃冰凍后取出解凍，分別于凍融前，凍融1次，凍融2次按尿液樣品處理方法進行測定吸光度，計算其枸櫞酸離子濃度，考察尿液樣品反復凍融2次的穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.3長期穩(wěn)定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個濃度尿樣標液，于-70℃冰箱保存，分別于配制當天、1周、2周和4周后取出，按尿液樣品處理方法進行測定吸光度，計算其枸櫞酸離子濃度，以考察尿液樣品長期冷凍穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于6.0%(表2)。

結果表明：低、中、高3個濃度的尿樣在室溫下放置4h內、凍融2次、-70℃條件下貯存4周內考察枸櫞酸離子RSD均<7%，表明尿樣在室溫下4h內測定穩(wěn)定，凍融3次測定穩(wěn)定和-70℃條件下貯存4周內測定穩(wěn)定。

表2 枸櫞酸穩(wěn)定性

4 方法學試驗小結

通過檸檬酸裂解酶-苯肼顯色的方法，建立了尿液中枸櫞酸的測定方法，方法學試驗結果表明本檢測方法線性關系良好；精密度及準確度試驗均符合要求，尿中枸櫞酸低、中、高3種濃度的批間和批內變異均小于7.0%；穩(wěn)定性試驗表明枸櫞酸在尿液中穩(wěn)定性良好。方法學試驗表明，本試驗建立的檸檬酸裂解酶-苯肼顯色測定法檢測尿液中枸櫞酸含量符合生物樣品檢測要求。與其他分析方法比較[3～9]，該方法回收率高，方法穩(wěn)定經濟，操作簡便。本法可適用于枸櫞酸大樣本尿藥濃度測定。