張凱歌，胡倩梅，靳志恒，楊會會，楊路明，胡建斌，朱華玉

(河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，河南 鄭州 450002)

甜瓜(CucumismeloL.)為葫蘆科甜瓜屬二倍體一年生雙子葉植物，其果色、香、味俱佳、營養(yǎng)豐富且具有較高的經(jīng)濟價值，在世界各地廣泛栽培，為世界十大水果之一。中國的甜瓜栽培歷史已有 2 000 年以上[1]，是世界最大的甜瓜生產(chǎn)地。目前，關于甜瓜的起源研究依舊不夠明確，但大部分學者比較認同非洲[2-6]和亞洲[7-8]為甜瓜的起源馴化中心。中國是薄皮甜瓜的初級和次級起源中心，是厚皮甜瓜的次級起源中心[3,9-11]。甜瓜是葫蘆科植物中表型變異最為豐富的作物之一，在株型、葉片和果實等形態(tài)特征上具有廣泛的多樣性，其中果實的表型變異最為豐富，如果皮顏色、果面覆紋、果肉顏色、果肉硬度、可溶性固形物含量以及風味等[12-14]。KIRKBRIDE[15]依據(jù)營養(yǎng)器官和果實形態(tài)特征，幼果和子房上絨毛的長度以及分布將甜瓜分為厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。其后，又有學者將其分為2個亞種和16個變種[16]。中國在20世紀70年代末就開展了甜瓜種質(zhì)資源的收集與保存工作，為中國甜瓜科研工作者提供了一個很好的材料平臺。目前，國家西瓜甜瓜中期庫(由中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所建立)中保存的甜瓜種質(zhì)近 2 000 份[17]。中國目前收集的甜瓜種質(zhì)資源頗具規(guī)模，但在葉片、果實、種子等相關性狀的遺傳多樣性以及相關性的研究上缺乏系統(tǒng)分析。針對甜瓜遺傳多樣性的研究較多，但多為通過形態(tài)性狀進行遺傳多樣性分析[18-19]或利用各種分子標記來評價甜瓜種質(zhì)的遺傳多樣性[20-22]，而將分子數(shù)據(jù)同表型數(shù)據(jù)進行綜合分析的研究較少。本研究從國內(nèi)外甜瓜種質(zhì)資源中選取在葉片、果實和種子遺傳變異較大的219份甜瓜材料進行表型鑒定，在此基礎上進行形態(tài)性狀的相關性分析以及分子水平和形態(tài)水平的遺傳多樣性分析，旨在了解甜瓜種質(zhì)不同性狀間的互作關系以及遺傳多樣性的分布情況，為甜瓜種質(zhì)資源的收集、引進以及育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究收集了來自世界27個國家的219份甜瓜種質(zhì)資源(表1)。其中亞洲185份，分別來自于中國105份、印度44份、日本12份，土庫曼斯坦7份，以色列5份，阿富汗、韓國各3份，伊朗2份，馬爾代夫、馬來西亞、敘利亞、巴基斯坦各1份；北美洲16份，分別來自于美國12份，加拿大3份，墨西哥1份；南美洲1份來自厄瓜多爾；歐洲12份，包括土耳其3份、西班牙、英國、俄羅斯各2份，烏克蘭、希臘、法國各1份；非洲5份，其中包括埃及2份，津巴布韋、塞內(nèi)加爾、贊比亞各1份。這些材料包括88份厚皮甜瓜，96份薄皮甜瓜以及35份野生甜瓜。所有材料于2017、2018年在河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)毛莊實驗基地的塑料大棚進行種植，每份材料2個重復，每個重復內(nèi)4個單株。

表1 219份甜瓜種質(zhì)資源信息Table 1 The information of 219 melon germplasms

續(xù)表 219份甜瓜種質(zhì)資源信息Continuing table The information of 219 melon germplasms

續(xù)表 219份甜瓜種質(zhì)資源信息Continuing table The information of 219 melon germplasms

1.2 甜瓜種質(zhì)資源的表型性狀統(tǒng)計及分析

所有材料于果實成熟時期進行性狀調(diào)查和統(tǒng)計。統(tǒng)計性狀分為兩個類型，一類為質(zhì)量性狀，主要對其頻率分布和多樣性指數(shù)進行分析，包括19類質(zhì)量性狀，即果面絨毛、果面瘤、果面溝、果面棱、果肉香氣、網(wǎng)紋密度、網(wǎng)紋粗度、網(wǎng)紋分布、果面裂紋、果面覆紋形狀、果皮底色、果面覆紋顏色、外果肉色、內(nèi)果肉色、瓜瓤顏色、種皮顏色、果實形狀、種子形狀以及葉片缺刻，另一類性狀為數(shù)量性狀，包括單果質(zhì)量、果實長度、果實寬度、果形指數(shù)、果肉厚度、果肉硬度、可溶性固形物含量、葉片長度、葉片寬度、葉形指數(shù)、葉柄長度、種子千粒質(zhì)量、種子長度、種子寬度、種形指數(shù)共計15個性狀。表型調(diào)查中用直尺測量長度；用電子秤測定質(zhì)量；果肉硬度用果實硬度計(杭州綠博，型號：GY-1)測量，可溶性固形物用數(shù)顯糖度計(日本愛拓，型號：PAL-α)測量。

所有表型性狀調(diào)查標準參考《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[23]的標準與方法進行統(tǒng)計、分級和賦值，質(zhì)量性狀以1～10級進行記錄(表2)并統(tǒng)計頻率，數(shù)量性狀參照胡建斌等[19]的方法，根據(jù)平均值(X)和標準差(S)把數(shù)據(jù)分為10級，1級<(x-2s)，10級≥(x+2s)，每 0.5s為一級，統(tǒng)計各級分布頻率。各個性狀遺傳多樣性采用Shannon′s信息指數(shù)(H′)進行評價，計算公式為：

H′=-ΣPilnPi，

式中：Pi為第i種變異類型出現(xiàn)的頻率， ln為自然對數(shù)。

基于部分質(zhì)量性狀的復雜性，如顏色類、形狀類、網(wǎng)紋類等，將該類性狀拆分為二進制性狀[24]，如：果皮底色可以拆分為白色底色、淺綠底色、深綠底色、淺黃底色、深黃底色、橘色底色6個性狀，各個質(zhì)量性狀按照質(zhì)量性狀分級情況進行拆分，共計獲得72個二進制質(zhì)量性狀。所獲得的72個質(zhì)量性狀和15個數(shù)量性狀計算219份種質(zhì)的均值，利用MEGA 6.0 和 R 3.5.1對其進行表型性狀的聚類分析、相關性分析和主成分分析，聚類方法為非加權配對算數(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)。

表2 甜瓜種質(zhì)資源質(zhì)量性狀描述分級Table 2 Description and classification of qualitative characters of melon germplasms

1.3 分子數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在材料定植21 d后，每份材料采4株等量幼嫩葉片混合，用CTAB法[25]提取DNA，用分光光度計對所提取的DNA進行質(zhì)量檢測，將所有樣本稀釋至10 ng·μL-1以備PCR擴增使用。本研究所用22對SSR(Simple Sequence Repeats)引物由ZHU等[26]從甜瓜全基因組開發(fā)設計(表3)。PCR流程及標記多態(tài)性分析參考ZHU等[26]的方法。

使用Structure 2.3.4對219份甜瓜種質(zhì)的基因型數(shù)據(jù)進行基于貝葉斯算法的群體結構分析[27-28]，以確定試驗群體的亞群數(shù)目，以及材料的遺傳背景。通過lnP(D)值和ΔK來確定真正的K值[29]。利用MEGA 6.0對219份甜瓜種質(zhì)進行聚類分析。使用R語言 3.5.1對219份甜瓜種質(zhì)進行主成分分析。

表3 22對SSR引物信息Table 3 22 pairs of SSR primer information

2 結果與分析

2.1 甜瓜種質(zhì)資源表型性狀分析

2.1.1 甜瓜種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性分析 基于質(zhì)量性狀的分級情況對219份甜瓜種質(zhì)資源的19個質(zhì)量性狀進行賦值，分別統(tǒng)計各個性狀的頻率和多樣性指數(shù)(表4)。質(zhì)量性狀多樣指數(shù)變幅為0.09～1.96，果面瘤遺傳多樣性指數(shù)最低(0.09)，果實形狀遺傳多樣性指數(shù)最高(1.96)。7個質(zhì)量性狀(果面覆紋形狀、果皮底色、果面覆紋顏色、內(nèi)果肉色、瓜瓤顏色、果實形狀、葉片缺刻)在數(shù)據(jù)統(tǒng)計中，多樣性指數(shù)均大于等于1.0。果實形狀以梨形(0.22)、卵圓(0.22)和圓形(0.19)為主；果皮底色以深綠(0.29)和淺綠(0.25)為主。在分析的所有材料中，48%的材料沒有覆紋，而有覆紋的材料覆紋形狀以斑條(0.14)和條帶(0.15)為主，且以深綠(0.30)為主；瓜瓤顏色以橘色(0.39)和白色(0.32)為主；內(nèi)果肉色以白色(0.48)和綠色(0.25)為主，外果肉色也以白色(0.33)和綠色(0.57)為主；葉片缺刻以淺缺刻(0.55)為主；種皮顏色以黃色(0.77)為主，種子形狀以卵圓(0.68)為主。大部分成熟果實沒有果面絨毛(0.62)、果面瘤(0.98)、果面溝(0.54)、果面棱(0.83)、果面網(wǎng)紋(0.89)和果面裂紋(0.88)，果實表面比較光滑，而有網(wǎng)紋的種質(zhì)網(wǎng)紋多為密(0.05)、細(0.05)、全(0.07)(表4)。

表4 219份甜瓜種質(zhì)資源質(zhì)量性狀頻率分布及多樣性Table 4 Frequency distribution and diversity index of qualitative traits of 219 melon germplasms

219份甜瓜種質(zhì)在15個數(shù)量性狀中也表現(xiàn)出廣泛的變異(表5)，除種型指數(shù)多樣性指數(shù)小于1(0.95)外，其他性狀均高于1，變幅為0.95～2.09，其中可溶性固形物、葉片寬度和葉柄長度多樣性指數(shù)最高。果肉厚度(0.50)、果肉硬度(0.53)、種子寬度(0.57)、種子千粒質(zhì)量(0.60)、果實長度(0.65)、果型指數(shù)(0.68)、果實質(zhì)量(0.93)的變異系數(shù)均超過了0.5，表明這7個數(shù)量性狀可以進行遺傳改良的潛力較大；其他8個數(shù)量性狀的變異系數(shù)較小(0.12～0.38)，表明其在219份甜瓜種質(zhì)之間變異較小。

表5 219份甜瓜種質(zhì)資源數(shù)量性狀變異統(tǒng)計分析Table 5 Analysis of variation of quantitative traits for 219 melon germplasms

2.1.2 甜瓜種質(zhì)資源表型性狀相關性分析 在田間性狀調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，部分表型性狀之間存在較高的關聯(lián)，對87個表型性狀進行了相關性分析(圖1)。結果表明，本研究所用219份甜瓜種質(zhì)資源的87個表型性狀中有較多的性狀之間存在相關性關系，除發(fā)現(xiàn)果實長度、果實寬度、果實質(zhì)量、果肉厚度、種子長、種子寬、葉片長、葉片寬等性狀之間存在比較常見的正相關關系外，還發(fā)現(xiàn)外果肉橙、內(nèi)果肉橙、瓜瓤橘之間存在極高的正相關關系；且瓜瓤桔和瓜瓤白，種皮白和種皮黃，外果肉白和外果肉綠之間存在極高的負相關關系。

2.1.3 甜瓜種質(zhì)資源表型性狀聚類分析和主成分分析 通過對87個表型性狀進行UPGMA法聚類分析(圖2)。從圖2可看出，厚皮材料相對集中，其中M193、M173、M176、M137、M163、M191、M198和M96表型性狀歸類為厚皮，與其材料類型不一致，從表型來看，這8份材料與厚皮更為接近，從遺傳角度分析其可能存在更多的厚皮背景。聚類圖中薄皮與野生材料相互交織在一起，并沒有按照其材料類型區(qū)分開，說明從表型性狀來看，薄皮和野生材料的表型相似度高，這可能是由于薄皮和野生材料遺傳背景比較接近。

對219份甜瓜種質(zhì)資源的表型性狀進行主成分分析(圖3)，前兩個特征向量累計解釋了21.7%的總變異，第一和第二特征向量分別解釋了14%和7.7%的變異。這兩個特征向量可以將219份種質(zhì)分為3個區(qū)域，厚皮區(qū)域(紅色)、薄皮區(qū)域(藍色)、野生區(qū)域(暗綠色)，在3種類型交匯處有部分材料并不能完全區(qū)分開厚皮、薄皮和野生材料，表明單純的形態(tài)學標記不能很好的區(qū)分種質(zhì)類型。

圖1 87個性狀相關性熱圖Fig.1 Correlation across 87 morphological traits

圖2 基于表型性狀對甜瓜種質(zhì)資源的聚類分析Fig.2 Clustering of melon germplasms based on phenotypic traits

圖3 219份甜瓜種質(zhì)形態(tài)學標記主坐標分析圖Fig.3 The principal components analysis of 219 melon germplasms

2.2 甜瓜種質(zhì)資源SSR標記遺傳多樣性分析

2.2.1 甜瓜種質(zhì)資源SSR位點遺傳多樣性分析 22對SSR標記在219份材料中共擴增出130個等位位點(表6)，平均每對引物5.91個位點，其中引物CmSSR04895位點最多為11個，CmSSR13690、CmSSR15606和CmSSR18058最少僅有3個，表明這些引物在本研究的219份材料中具有較好的多態(tài)性。全部引物的Ne變幅為1.07～3.74，CmSSR06905最大，CmSSR15606最小，平均2.44。Ho變幅為0.63～0.97，CmSSR15606最大，CmSSR12254最小，平均0.88。He變幅為0.03～0.37，CmSSR12254最大，CmSSR15606最小，平均0.12。PIC變幅為0.07～0.71，CmSSR06905最大，CmSSR15606最小，除CmSSR15606的PIC值低于0.25外，其他引物均高于0.25，表明該套SSR標記具有較高的多態(tài)性。Shannon’s指數(shù)變異范圍在0.16～1.69之間，CmSSR15606最小，CmSSR06905最大，平均為1.07。從He、Ho、PIC以及Shannon’s指數(shù)值可以看出本研究的群體的遺傳多樣性相對豐富。

表6 22對引物在219份甜瓜材料中的遺傳多樣性Table 6 Genetic diversity of 219 melon germplasms based on 22 SSR markers

注：Na：觀測等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；I：Shannon-Weaver指數(shù)；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；PIC：多態(tài)性信息含量。

Note:Na:observed allele number;Ne:effective allele number;I:Shannon-Weaver index; Ho:observed heterozygosity;He:expected heterozygosity; PIC:polymorphism information content.

2.2.2 甜瓜種質(zhì)資源群體結構分析 依據(jù)基因型數(shù)據(jù)，本研究利用Structure 2.3.4對219份甜瓜種質(zhì)資源進行分析，以確定研究群體的最佳亞群數(shù)目。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)lnP(D)隨著K值的增大持續(xù)增加(圖4-A)，難以確定真實的K值，故而參照EVANNO 等[29]的方法通過ΔK值來確定合適的K值。由圖4可知，當K=3時ΔK有最大值324.94，因此可以將材料區(qū)分為3個亞群(圖4-B)。其中72份材料歸屬于P1，包括70份厚皮材料和2份薄皮材料，其中43份來自亞洲，13份來自北美洲，12份來自歐洲，3份來自非洲，1份來自南美洲；39份材料歸屬于P2，包括32份野生材料和6份厚皮材料及1份薄皮材料，其中34份來自于亞洲的印度，剩下的5份分別來自于亞洲的馬爾代夫和中國，北美洲的美國和墨西哥及非洲的津巴布韋；108份材料歸屬于P3，包括92份薄皮材料、13份厚皮材料和3份野生材料，其中106份來自于亞洲，2份分別來自非洲和北美洲。材料分類情況基本與厚皮、薄皮以及野生材料的原始分類比較接近，僅有25份材料(P12份，P27份，P316份)與原始分類不一致，25份材料中除M6、M34、M78、M82、M85、M158、M159這7份材料遺傳背景較雜亂外，其余材料的遺傳背景都比較單純(圖4-B)。綜上所述，除了利用表型性狀作為分類標準外，分子數(shù)據(jù)亦應納入分類標準。

A：219份甜瓜群體lnP(D)值和ΔK值隨K值變化圖；B：219份甜瓜種質(zhì)群體結構示意圖A： lnP(D) and ΔK with change of K values in the 219 melon germplasms; B：Population structure of the 219 melon germplasms

2.2.3 甜瓜種質(zhì)資源聚類分析以及主成分分析 利用MEGA6.0對219份供試材料進行聚類分析?？蓪?19份材料分為3類(圖5)。其中在第Ⅰ類，除4份薄皮材料外其他均為厚皮材料；第Ⅱ類除M42、M71外，其他均為野生材料；第Ⅲ類除16份厚皮種質(zhì)和7份野生種質(zhì)外，其他均為薄皮材料，而這未按照原分類聚類的29份材料中有23份材料與Structure分類結果一致，故而無論從遺傳背景還是進化關系，這23份材料均應重新進行分類。從圖6可以看出，材料所在地域與材料類型并沒有明顯關系。同時從進化角度來看，薄皮材料與野生材料的親緣關系更近(圖5)。

圖5 基于SSR標記對甜瓜種質(zhì)資源的聚類分析Fig.5 Clustering analysis of melon germplasms based on SSR markers

對219份甜瓜種質(zhì)的SSR標記數(shù)據(jù)進行主成分分析(圖6)，前2個特征向量解釋了21.6%的總變異，第一和第二特征向量分別解釋了13.9%和7.7%的變異。這兩個特征向量可以將219份種質(zhì)分為3個區(qū)域，厚皮區(qū)域(紅色)、薄皮區(qū)域(藍色)、野生區(qū)域(暗綠色)，厚皮和薄皮材料分布較集中，野生材料相對較為分散，這可能和不同種質(zhì)類型的多樣性程度有關。其中有部分材料原始分類與在圖中分布不一致，經(jīng)比較圖6中不同類型材料中混雜的其他類型材料和Structure結果一致，表明種質(zhì)入庫記錄并不完全正確，仍舊需要育種工作者對該方面進一步進行分析核實。

2.2.4 23份甜瓜種質(zhì)資源的重新歸類 本研究通過將分子數(shù)據(jù)的Structure結果和MEGA結果進行比對，發(fā)現(xiàn)有23份材料的初始歸類類型可能存在問題。因此，本研究推測該23份種質(zhì)的歸類情況應當如表7所示。

圖6 基于SSR標記的主坐標分析圖Fig.6 The principal components analysis based on SSR markers

表7 23份甜瓜種質(zhì)資源的重新歸類Table 7 Re-categorization of 23 melon germplasm resources

3 討論與結論

豐富多樣的種質(zhì)資源是研究人員選育新品種和研究物種起源、進化及分類的基礎。甜瓜作為葫蘆科植物中表型變異最為豐富的作物之一，育種工作者針對不同方向利用不同方法對其進行了廣泛的研究[26,30-34]。雖然研究人員利用不同的甜瓜種質(zhì)資源對表型性狀進行遺傳多樣性分析[35-36]，但其所研究的性狀數(shù)目均低于本研究的19類質(zhì)量性狀和15個數(shù)量性狀。本研究所分析的表型性狀更為豐富、全面，且本研究參考FANG 等[37]對大豆表型性狀的研究方法，首次將甜瓜質(zhì)量性狀進行拆分，簡化了性狀之間相關性的復雜程度，而間接鑒定法的重要依據(jù)就是以不同表型性狀相互之間的相關關系，基因之間的連鎖互作為其本質(zhì)，可以通過某一性狀預測其相關性狀的表現(xiàn)，該項工作的細化研究將為甜瓜多個優(yōu)良性狀進行融合提供了理論依據(jù)，對育種工作有重要的參考應用價值，可以很大程度提高常規(guī)育種的效率。

生物進化和育種的基礎是種質(zhì)遺傳多樣性，通過形態(tài)學標記的遺傳多樣性研究，可以從整體了解種質(zhì)資源的豐富程度，為育種者提供重要的信息。盡管由于環(huán)境因素的影響通過形態(tài)學標記所獲得的結論往往不夠完善，但相較于分子標記其可以在宏觀水平直接明了地同表型性狀相結合起來。在本研究表型性狀遺傳多樣性分析中分別有7個質(zhì)量性狀和14個數(shù)量性狀遺傳多樣性指數(shù)≥1，7個數(shù)量性狀變異系數(shù)≥50%，這與前人檢測到的具有較高多樣性指數(shù)和變異系數(shù)的性狀比較一致[18-19,36]，上述14個具有較高多樣性指數(shù)和變異系數(shù)的性狀遺傳改良的潛力較大，這為甜瓜某些表型性狀基因的精細定位和圖位克隆提供了優(yōu)異的親本材料。

隨著基因時代的到來,遺傳多樣性研究也進入了分子水平[24,38]，利用分子標記可以更為精確地從分子水平了解作物的遺傳多樣性研究。本研究除對表型性狀進行遺傳多樣性分析外，亦在分子水平上對219份種質(zhì)的遺傳多樣性及群體結構進行分析。相較于形態(tài)學標記，分子標記受環(huán)境因素影響小，具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，并且還具有數(shù)量豐富和多態(tài)性高的優(yōu)點，可以全方位的對種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析[38]。本研究22個標記中除CmSSR15606的PIC值低于0.25外，均具有較高的He、Ho以及PIC值，可以在一定程度上反應群體材料的遺傳多樣性程度，本研究的平均Shannon’s值為1.07，Shannon’s大小可以用來反映群體的遺傳變異豐富程度，本研究與ZHU 等[30]利用42個分子標記在對118份甜瓜材料部分相同，且研究中得到的Na、Ho、Shannon’s、PIC的值相差不大。本研究的平均等位基因位點為5.91，高于KONG 等[39]利用EST-SSR進行27個甜瓜材料的研究中的3.01，本研究與王盼喬等[40]利用EST-SSR標記對47份甜瓜材料的研究結果對比發(fā)現(xiàn)，本研究的Na、Ne、Ho、He、PIC平均值均高于其平均值。表明本研究所用的22個標記具有較高的多態(tài)性，即本研究所用的219份種質(zhì)材料之間存在較大的遺傳差異。

形態(tài)學標記和分子標記技術相結合能夠準確把握種質(zhì)資源遺傳多樣性本質(zhì)，因此本研究結合數(shù)據(jù)分析結果，對初始歸類類型可能存在問題的23份種質(zhì)進行了重新分類。一些學者在研究中發(fā)現(xiàn)SSR標記的多樣性信息指數(shù)明顯低于形態(tài)學標記[41-45]，本研究與前人研究結果一致(形態(tài)學標記遺傳多樣性指數(shù)=1.29，分子標記遺傳多樣性指數(shù)=1.07)，但通過比較分子數(shù)據(jù)的MEGA聚類結果和Structure結果發(fā)現(xiàn)，有213份材料始終分類一致，相較于形態(tài)學標記的MEGA聚類結果和主成分結果，分子標記更為穩(wěn)定，更能夠正確反應材料的遺傳背景以及材料之間的親緣關系。