董雨衡， 毛國(guó)濤， 謝慧， 張宏森， 王風(fēng)芹， 宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鈣離子(Ca2+)是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的信使分子，但在原核生物中的功能尚不清楚。研究表明，鈣離子能夠影響細(xì)菌芽孢的形成、趨化性、異形胞分化、物質(zhì)運(yùn)輸和侵染等生理過(guò)程[1]。鈣離子結(jié)合蛋白(calcium binding protein，CaBPs)是對(duì)鈣離子有高度親和性的蛋白質(zhì)，在與其他細(xì)胞成分相互作用時(shí)需要鈣離子參與。真核生物CaBPs大多具有典型的EF手型(exchange factor hand，EF-hand)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)由1個(gè)α螺旋、1個(gè)loop環(huán)和1個(gè)α螺旋構(gòu)成，2個(gè)螺旋呈現(xiàn)近似垂直的形態(tài)。隨著研究深入，在細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了具有EF-hand結(jié)構(gòu)的CaBPs。來(lái)自糖多孢菌(Saccharopolysporaerythrea)的Calerythrin蛋白質(zhì)是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的原核CaBPs，具有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)，其中3個(gè)能結(jié)合鈣離子，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)主要起鈣緩沖的作用[2]。來(lái)自根瘤菌(Rhizobiumetili)的Calsymin蛋白質(zhì)是具有6個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)的CaBPs，當(dāng)編碼Calsymin蛋白質(zhì)的基因casA被敲除后，根瘤菌失去了與宿主共生的能力[3]。原核生物中CaBPs結(jié)構(gòu)具有多樣性，如在毒素蛋白家族(repeats in the structural toxin, RTX)中存在的β桶狀結(jié)構(gòu)(β-roll)序列重復(fù)結(jié)構(gòu)、βγ-晶狀體蛋白中的希臘鑰匙(Greek key)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白質(zhì)類(lèi)似蛋白質(zhì)(bacterial proteins with immunglobulin-like, Big-like)結(jié)構(gòu)域等都具有鈣離子結(jié)合能力[1]。盡管目前有些原核細(xì)胞CaBPs已經(jīng)被鑒定出來(lái)，但是對(duì)其表征和功能鑒定等方面還缺乏進(jìn)一步研究。

丁醇是具有廣闊前景的高效清潔生物能源，傳統(tǒng)的生物丁醇發(fā)酵是 ABE(丙酮、丁醇和乙醇)發(fā)酵，產(chǎn)物的得率受到鈣離子的調(diào)控。CATHERINE等[4]研究表明，在P2培養(yǎng)基中添加碳酸鈣能顯著提高丙酮丁醇梭菌ATCC 824和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)260的菌體生長(zhǎng)速率和糖利用速率，菌體對(duì)丁醇的耐受能力提高了40%以上，總?cè)軇┑漠a(chǎn)量提高31%～46%。LV等[5]研究表明，在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣可以使拜氏梭菌NCIMB 8052退化菌株DG-8052的菌體生長(zhǎng)和溶劑產(chǎn)生提高了50%以上。蘇增平[6]研究表明，在玉米秸稈水解液中添加碳酸鈣或者胞內(nèi)鈣抑制劑后，鈣離子對(duì)丙酮丁醇梭菌輔酶A活力有較大的影響。HAN等[7]在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣后發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他緩沖鹽而言，拜氏梭菌溶劑產(chǎn)量得到顯著提高，添加氯化鈣同樣可以提高溶劑的產(chǎn)量。這些研究間接表明，碳酸鈣的緩沖作用只是其提高溶劑產(chǎn)量的原因之一，鈣離子的其他生理功能尚需要進(jìn)一步研究。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了丙酮丁醇梭菌ATCC 824 CaBPs結(jié)構(gòu)和功能多樣性，以期為揭示鈣離子對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的影響機(jī)制及高產(chǎn)菌株的理性構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌CaBPs的結(jié)構(gòu)域特征基序

目前原核生物CaBPs的鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要有EF-hand(具有l(wèi)oop環(huán)保守序列)、Greek key、重復(fù)的β-roll和Big-like共4種CaBPs的保守特征基序[8-14]，具體基序如下：

EF-hand基序：D.[DNS].[DENSTG].{3} [DENQSTAGC].{2}[DE]

Greek key基序：[DN][DN].{2}[TS]S

β-roll基序：GG.G.D.[GVALIPSCMNQT].

Big-like基序：DNSNKDITSAVTD.SN.D.{2}S.VT

其中，“.”代表1個(gè)任意的氨基酸殘基，“[ ]”代表該位置的氨基酸殘基是可變的，“{ }”代表1個(gè)氨基酸殘基特定的重復(fù)次數(shù)。

1.2 丙酮丁醇梭菌數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到模式菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824(GenBank: AE001437)全基因序列及蛋白質(zhì)序列信息，并構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得各蛋白質(zhì)相應(yīng)的核酸序列和蛋白質(zhì)序列。通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)查詢(xún)丙酮丁醇梭菌(Taxon: 272562)的GO注釋信息，分別以生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能的GO注釋信息構(gòu)建本地背景數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)查詢(xún)KO注釋信息并構(gòu)建本地背景數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行通路分析。

1.3 CaBPs預(yù)測(cè)及分析

通過(guò)典型的鈣離子結(jié)合loop環(huán)結(jié)構(gòu)基序在Protein Pattern Find(http://www.bioinformatics.org/sms2/protein_pattern.html)對(duì)上述數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，得到含特定基序的蛋白質(zhì)序列。由于所做背景數(shù)據(jù)庫(kù)均是以Uniprot ID為基礎(chǔ)，故將預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)名字通過(guò)Uniprot(https://www.uniprot.org/uploadlists/)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換。通過(guò)OmicShare(https://www.omicshare.com/)的GO功能分類(lèi)和KEGG通路分析工具對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaBPs的結(jié)構(gòu)多樣性

2.1.1 EF-hand結(jié)構(gòu)的CaBPs 典型的EF-hand結(jié)構(gòu)由“螺旋-環(huán)-螺旋”構(gòu)成，2個(gè)螺旋呈現(xiàn)近似垂直的形態(tài)，loop環(huán)中殘基提供鈣離子配位結(jié)構(gòu)中所需的的氧原子，在1(X)、3(Y)、5(Z)、7(-Y)、9(-X)和12(-Z)位置與鈣離子形成配體，3位置的殘基通過(guò)主鏈羰基氧原子與鈣離子結(jié)合。雖然CaBPs的EF-hand結(jié)構(gòu)大多成對(duì)出現(xiàn)，但具有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)的CaBPs也有報(bào)道。例如鈣離子通道蛋白的Cav1.2亞基C端有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)，并且在功能上能維持鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡[15]；海藻酸結(jié)合蛋白中1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)也具有結(jié)合鈣離子的能力[16]。因此，一些研究者認(rèn)為有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)也可能具有鈣離子結(jié)合的能力。本研究以具有鈣離子結(jié)合能力的loop環(huán)的特征序列基序進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)221個(gè)具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中21個(gè)蛋白質(zhì)具有2個(gè)以上EF-hand結(jié)構(gòu)(表1)，另外200個(gè)蛋白質(zhì)則只具有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)。

表1 丙酮丁醇梭菌ATCC824通過(guò)基序匹配得到的鈣離子結(jié)合蛋白部分結(jié)果Table 1 Partial results of CaBPs obtained by motif matching of Clostridium acetobutylicum ATCC824

注：黑色加粗序列為匹配到的基序。下同。

Note: Black bold sequence is the matched motif. The same as below.

2.1.2 Greek key結(jié)構(gòu)的βγ-晶體蛋白質(zhì)家族 在真菌、細(xì)菌以及古菌中發(fā)現(xiàn)有大量結(jié)合鈣離子的非晶狀體βγ-晶狀體蛋白，這類(lèi)蛋白質(zhì)一般由單個(gè)或多個(gè)Greek key結(jié)構(gòu)構(gòu)成，每2個(gè)結(jié)構(gòu)之間通過(guò)1條短肽鏈連接，整個(gè)分子呈高度對(duì)稱(chēng)并且能夠形成大小不同的多聚體，主要功能是壓力應(yīng)激蛋白質(zhì)以協(xié)助微生物抵御不利生存環(huán)境[17]。通過(guò)蛋白質(zhì)Greek key基序序列與丙酮丁醇梭菌ATCC824全蛋白質(zhì)組對(duì)比，得到119個(gè)蛋白質(zhì)序列，其中具有2～3個(gè)Greek key結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有8個(gè)(表2)。Greek key結(jié)構(gòu)一般成對(duì)出現(xiàn)，形成2個(gè)反向平行的β折疊股結(jié)構(gòu)(β-strand)，故認(rèn)為具有1個(gè)Greek key結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對(duì)鈣離子的親和力較差。

表2 Greek key基序與丙酮丁醇梭菌ATCC824蛋白質(zhì)組匹配結(jié)果Table 2 The matching result of Greek key motif with the proteome of Clostridium acetobutylicum ATCC824

2.1.3 β-roll結(jié)構(gòu)的RTX蛋白質(zhì)家族 一些革蘭氏陰性菌能夠分泌具有β-roll或者β-heliex結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包含外毒素RTX結(jié)構(gòu)。RTX結(jié)構(gòu)域由GG.G.D.[GVALIPSCMNQT].順式重復(fù)排列構(gòu)成，在不同的RTX家族成員重復(fù)5～45次，前6個(gè)氨基酸與鈣離子結(jié)合形成配體，后3個(gè)形成β-strand結(jié)構(gòu)。利用此特征的RTX 基序進(jìn)行比對(duì)后得到7個(gè)具有β-roll結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，但是這7個(gè)蛋白質(zhì)只具有1個(gè)特征基序結(jié)構(gòu)，不構(gòu)成重復(fù)排列，認(rèn)為其結(jié)合鈣離子能力較弱。

2.1.4 BIg-like domain結(jié)構(gòu)的CaBPs 近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)菌免疫球蛋白質(zhì)類(lèi)似的蛋白質(zhì)也具有鈣離子結(jié)合能力，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)的保守鈣離子結(jié)合基序與丙酮丁醇梭菌ATCC824全蛋白質(zhì)組對(duì)比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有該結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

2.2 丙酮丁醇梭菌CaBPs的GO功能分析

基因本體論是國(guó)際通用的描述基因分類(lèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)，統(tǒng)計(jì)上述各保守特征基序預(yù)測(cè)到的蛋白質(zhì)，將221個(gè)具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和8個(gè)具有Greek key結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)共228個(gè)(有1個(gè)重復(fù))目標(biāo)蛋白質(zhì)基因，通過(guò)本地丙酮丁醇梭菌GO背景數(shù)據(jù)庫(kù)分析，以了解這些蛋白質(zhì)在丙酮丁醇梭菌中的分布情況。經(jīng)過(guò)分析這些蛋白質(zhì)參與生物過(guò)程的有11個(gè)功能組，共計(jì)121個(gè)基因，主要集中在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單細(xì)胞過(guò)程3個(gè)方面，分別占總體的26.89%、23.25%、17.37%(圖1-A)；組成細(xì)胞組分的有8個(gè)功能組，共計(jì)93個(gè)基因，主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜部分、細(xì)胞和細(xì)胞部分4個(gè)方面，分別占總體的27.60%、26.24%、18.55%和18.55%(圖1-B)；具有分子功能的有9個(gè)功能組，共計(jì)151個(gè)基因，主要集中在催化活力和結(jié)合2個(gè)方面，分別占總體的51.68%和35.29%(圖1-C)。

2.3 丙酮丁醇梭菌預(yù)測(cè)CaBPs的KEGG代謝通路分析

通過(guò)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中分析上述CaBPs以了解其參與的代謝途徑。根據(jù)丙酮丁醇梭菌KEGG注釋信息對(duì)上述228個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行通路分析。其中共有211個(gè)蛋白質(zhì)被注釋?zhuān)@些蛋白質(zhì)涉及59個(gè)代謝途徑，表3中顯示了蛋白質(zhì)參與途徑相對(duì)較多的14個(gè)代謝途徑，主要包括代謝過(guò)程蛋白質(zhì)36個(gè)、生物抗性基因合成蛋白質(zhì)15個(gè)、次級(jí)代謝物生物合成蛋白質(zhì)15個(gè)和信號(hào)傳導(dǎo)雙組份系統(tǒng)蛋白質(zhì)13個(gè)，分別占總體的17.06%、7.11%、7.11%和6.16%。在其他途徑中，比如參與氨基酸代謝的丙氨酸、天門(mén)冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸途徑等均低于3個(gè)蛋白質(zhì)；參與丙酮酸代謝、核糖體、磷酸戊糖途徑以及糖酵解等均只有1個(gè)蛋白質(zhì)。

A：生物學(xué)過(guò)程；B：細(xì)胞組分；C：分子功能

表3 蛋白質(zhì)參與最多的14個(gè)代謝途徑

Table 3 Top fourteen metabolic pathways involving proteins

代謝途徑Metabolic pathway蛋白質(zhì)數(shù)量/個(gè)Number of proteins蛋白質(zhì)比例/%Percentage of proteins編碼IDCoding ID代謝過(guò)程Metabolic process3617.06ko01100抗生素生物合成Antibiotic biosynthesis157.11ko01130次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成Secondary metabolite biosynthesis157.11ko01110雙組份系統(tǒng)Two component system136.16ko02020氨基酸生物合成Amino acid biosynthesis94.27ko01230微生物代謝Microbial metabolism83.79ko01120氨基糖和核苷糖代謝Amino sugar and nucleoside sugar metabolism73.32ko00520嘌呤代謝Purine metabolism73.32ko00230

續(xù)表

2.4 丙酮丁醇梭菌CaBPs的主要功能類(lèi)群

通過(guò)GO與KEGG分析，在228個(gè)具有鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)中，主要包括13個(gè)與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)，其中有12個(gè)蛋白質(zhì)具有EF-hand結(jié)構(gòu)，1個(gè)蛋白質(zhì)具有Greek key結(jié)構(gòu)；4個(gè)與抗逆性相關(guān)蛋白質(zhì),都具有EF-hand結(jié)構(gòu)；12個(gè)與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)蛋白質(zhì)，其中有11個(gè)蛋白質(zhì)具有EF-hand結(jié)構(gòu)，1個(gè)蛋白質(zhì)具有Greek key結(jié)構(gòu)；9個(gè)與芽孢分化相關(guān)蛋白質(zhì),都具有EF-hand結(jié)構(gòu)；17個(gè)與鞭毛與趨化性相關(guān)蛋白質(zhì)，其中有16個(gè)蛋白質(zhì)具有EF-hand結(jié)構(gòu)，1個(gè)蛋白質(zhì)具有Greek key結(jié)構(gòu)；10個(gè)與催化活性相關(guān)蛋白質(zhì)。還有一些蛋白質(zhì)參與了DNA復(fù)制與修復(fù)、RNA合成、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞壁合成等過(guò)程，表4重點(diǎn)總結(jié)了在丙酮丁醇梭菌中預(yù)測(cè)的具有特定功能類(lèi)群的CaBPs。

表4 鈣離子結(jié)合蛋白主要功能類(lèi)群Table 4 Main functional groups of CaBPs

3 結(jié)論與討論

產(chǎn)溶劑梭菌是生物法產(chǎn)丁醇的主要菌株，而鈣離子對(duì)于丙酮丁醇梭菌的影響是顯著直觀的。相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，在芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌中有數(shù)百個(gè)基因受到外界環(huán)境中鈣離子的影響，受影響的過(guò)程主要包括三型分泌系統(tǒng)和多糖的產(chǎn)生等[18]。本研究從不同的CaBPs結(jié)合鈣離子的特征基序入手，預(yù)測(cè)了228個(gè)具有這些特征的蛋白質(zhì)，然后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能分類(lèi)和KEGG代謝通路分析。研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)蛋白質(zhì)主要集中在生物信號(hào)、運(yùn)動(dòng)調(diào)控、生物代謝催化和細(xì)胞抗逆性等方面，存在于雙組分系統(tǒng)、催化活性、碳水化合物運(yùn)輸、蛋白質(zhì)代謝、芽孢形成與分化、鞭毛的組裝與運(yùn)動(dòng)等通路中。通過(guò)對(duì)該類(lèi)蛋白質(zhì)功能分析，初步明確了鈣離子在丙酮丁醇梭菌中的作用，為深入了解鈣離子在丙酮丁醇梭菌中具體的生理功能和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

鈣離子作為信使分子能夠影響CaBPs生理狀態(tài)，從而調(diào)控菌體的生長(zhǎng)與代謝。CaBPs通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化與去磷酸化調(diào)控下游基因的表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與DNA結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[19]。本研究通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，丙酮丁醇梭菌CaBPs中有13個(gè)蛋白質(zhì)為信號(hào)傳導(dǎo)雙組份系統(tǒng)蛋白質(zhì)，如Q97M81和Q97IY1為感知傳導(dǎo)組氨酸激酶，Q97ET7為感知傳導(dǎo)蛋白質(zhì)，Q97IR1和Q97GZ5蛋白質(zhì)分別為趨化性感知傳導(dǎo)蛋白質(zhì)和趨化性組氨酸激酶，該類(lèi)蛋白質(zhì)可能為雙組份轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)成員，通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化與去磷酸化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Q97LI2為絲氨酸蛋白質(zhì)激酶，通過(guò)使其他蛋白質(zhì)磷酸與去磷酸化而影響蛋白質(zhì)的功能。Q97ML0、Q97JQ9、Q97IH3、Q97GB8和Q97D30為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Q97J80和Q97HC8為轉(zhuǎn)錄終止子，該類(lèi)蛋白質(zhì)可以直接與DNA結(jié)合從而啟動(dòng)或終止基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析有助于闡明蛋白質(zhì)的工作機(jī)制[20]。文獻(xiàn)報(bào)道具有催化活性纖維小體的腳手架前體蛋白質(zhì)中存在高度保守的EF-hand結(jié)構(gòu)，且具有鈣離子結(jié)合能力，鈣離子對(duì)誘導(dǎo)其折疊成正常的三級(jí)結(jié)構(gòu)有重要的影響[21]。本研究結(jié)果顯示，在丙酮丁醇梭菌中也發(fā)現(xiàn)了纖維小體，并且能夠表達(dá)但其催化活力極低，該菌不能以纖維素作為唯一碳源生長(zhǎng)[22]。丙酮丁醇梭菌ATCC 824的蛋白質(zhì)組比對(duì)發(fā)現(xiàn)有了10個(gè)具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中9個(gè)蛋白質(zhì)具有2個(gè)以上的EF-hand結(jié)構(gòu)，這些蛋白質(zhì)的功能分別為腳手架前體蛋白質(zhì)、纖維素酶前體和內(nèi)切葡萄糖苷酶前體，推測(cè)這些酶組裝成纖維小體需要鈣離子的參與，但具體功能尚需進(jìn)一步研究。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中存在一些ATP結(jié)合盒式蛋白質(zhì)(ATP-binding cassette transporter，ABC)，該蛋白質(zhì)家族是存在于所有生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，主要從事胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸，作用底物非常廣泛，比如金屬離子、糖類(lèi)、維生素等小分子，以及寡核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝產(chǎn)物等大分子化合物。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)還參與細(xì)胞解毒、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒防御以及抗原呈遞等許多重要的生理過(guò)程[23]。本研究結(jié)果顯示，在丙酮丁醇梭菌中發(fā)現(xiàn)具有鈣離子結(jié)合能力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)12個(gè)，金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)4個(gè)，其中Q97MQ1、Q97M30為預(yù)測(cè)的參與陽(yáng)離子外排蛋白質(zhì)；糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白質(zhì)1個(gè)；多種藥物、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白質(zhì)1個(gè)。

研究發(fā)現(xiàn)在純糖培養(yǎng)基中添加碳酸鈣后能夠消除甲酸對(duì)丙酮丁醇發(fā)酵的抑制作用，使溶劑產(chǎn)量提高近20倍[24]，間接說(shuō)明了在丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程中添加鈣離子可以提高菌體的抗逆能力。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中Q97H97為DnaK抑制蛋白質(zhì)DskA，可能與該菌的抗高溫等特性相關(guān)。Q97J76、Q97J74和Q97J73為碲酸鹽抗性相關(guān)蛋白質(zhì)，其相關(guān)功能研究目前較少。研究結(jié)果表明，炭疽桿菌碲酸鹽抗性基因(YCEG)突變后，毒力會(huì)降低并且對(duì)抗生素和紫外線(xiàn)等敏感性增加[25]，推測(cè)該基因和抗逆能力相關(guān)，并且受到金屬離子的影響。芽孢也是細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境的休眠體，芽孢內(nèi)高含量的吡啶二羧酸鈣是芽孢抗逆能力提高的關(guān)鍵，同時(shí)丙酮丁醇梭菌溶劑的產(chǎn)生與芽孢分化相耦合，即溶劑在芽孢形成的過(guò)程中產(chǎn)生，不能產(chǎn)生芽孢的退化菌種往往也就失去了產(chǎn)溶劑的能力[26]。在丙酮丁醇梭菌的基因組中有9個(gè)與芽孢形成相關(guān)的蛋白質(zhì)含有鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，表明鈣離子可能參與了調(diào)控芽孢形成和溶劑產(chǎn)生的過(guò)程。胞內(nèi)鈣離子濃度的變化能誘發(fā)大腸桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)(翻滾或單方向運(yùn)動(dòng))[27]。生物膜上的趨化受體蛋白質(zhì)感受外界刺激，然后傳遞到鞭毛馬達(dá)受體，從而表現(xiàn)出趨化性，使微生物產(chǎn)生響應(yīng)外界刺激的行為[28]。本研究結(jié)果中，丙酮丁醇梭菌有11個(gè)趨化性相關(guān)的蛋白質(zhì)和4個(gè)鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)都具有鈣離子結(jié)合特征基序，表明丙酮丁醇梭菌的運(yùn)動(dòng)與趨化性受到鈣離子的影響與調(diào)控。