高超男，宋鵬飛，姚雙艷，盛子耀，李為爭，羅梅浩，原國輝

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河南 鄭州 450002)

亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)是黃淮海流域夏玉米田最嚴重的蛀穗、蛀莖害蟲之一。玉米莖稈被蛀后，營養(yǎng)運輸阻斷，整體長勢衰弱；穗部被蛀后的機械損傷口還易誘發(fā)玉米穗腐病等病害[1-2]。一般可以使夏玉米減產(chǎn)20%～30%，嚴重時減產(chǎn)達30%以上[3]。幼蟲的隱蔽取食習(xí)性給農(nóng)藥防治帶來很大困難[4-5]。因此，探索玉米自身抗蟲物質(zhì)與亞洲玉米螟取食的相互調(diào)控機制，對于玉米抗蟲良種選育具有重要意義。異羥肟酸類是玉米產(chǎn)生的主要防衛(wèi)性次生代謝物，典型代表是丁布(2,4-二羥基-7-甲氧基-1,4-苯并惡嗪-3-酮)，對植食性昆蟲具有廣譜抗性[6]。受丁布影響的玉米害蟲包括亞洲玉米螟[7-10]、歐洲玉米螟O.nubilalis[11]、西南玉米桿草螟Diatraeagrandiosella[12]、粉紅莖螟Sesamianonagrioides[13]、甜菜夜蛾Spodopteraexigua[14]、南方灰翅夜蛾S.eridania[15]、豆稈野螟O.scapulalis和虎杖螟O.latipennis[10]、玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera[16]等。植物防衛(wèi)物分為構(gòu)成性防衛(wèi)物和誘導(dǎo)性防衛(wèi)物，前者是植物生長發(fā)育過程中自發(fā)產(chǎn)生的，后者則是外源因素誘導(dǎo)才會產(chǎn)生的，二者的合成往往是以生物量積累速度延緩為代價的[17]。針對蟲害這種偶發(fā)性威脅，很顯然誘導(dǎo)性防衛(wèi)對植物而言更有優(yōu)勢[6]。因此，推測禾本科植物中的丁布可能也是蟲害誘導(dǎo)產(chǎn)生的化學(xué)防衛(wèi)物。

調(diào)控玉米葉片中丁布合成量的外源因子包括物理因子、化學(xué)因子、生物因子三大類。物理因子如機械損傷和高溫[18]、光照[18-19]、水脅迫[20]等；化學(xué)因子如茉莉酸[17]、茉莉酸甲酯[21-22]、水楊酸甲酯[18,22]等；當前生物因子對禾本科作物中丁布含量的影響了解不多，主要包括伴生性雜草[23-24]和昆蟲取食[18]。例如，經(jīng)過大頭針機械損傷后，農(nóng)大108和連玉15的玉米葉片中丁布含量(分別為1.001 567和1.416 224 mg·g-1)和對照(分別為0.905 877和0.948 377 mg·g-1)相比均顯著增加；但2個品種3齡亞洲玉米螟幼蟲取食損傷的反應(yīng)卻不同，蟲害損傷的農(nóng)大108葉片丁布含量(1.282 654 mg·g-1)極顯著高于對照，但連玉15經(jīng)亞洲玉米螟取食損傷后丁布含量(1.024 665 mg·g-1)和對照相比卻沒有顯著差異。丁布的主要生態(tài)學(xué)功能是防衛(wèi)植食性昆蟲。然而，植食性昆蟲這種潛在生物因子對丁布生物合成的逆向調(diào)控作用目前尚缺乏系統(tǒng)的研究，尤其是丁布合成量與害蟲種群密度、取食持續(xù)時間、葉片損傷程度等因素之間的關(guān)系。本研究通過機械損傷、亞洲玉米螟取食和模擬取食等誘導(dǎo)處理玉米葉片，每個處理內(nèi)部各設(shè)置不同的誘導(dǎo)時間，然后測定玉米葉片丁布含量的變化，以便弄清丁布是蟲害誘導(dǎo)性還是構(gòu)成性化學(xué)防衛(wèi)物質(zhì)，為抗蟲玉米品種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

亞洲玉米螟為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)實驗室飼養(yǎng)(14 L∶10 D，(27±1)℃，相對濕度65%～85% )。飼料制備方法為：取716.2 g蒸餾水，加入11.5 g瓊脂、2.9 g山梨酸后煮沸，然后加入86 g玉米粉、86 g大豆粉、51.6 g酵母粉和43 g葡萄糖，充分攪拌，物料降低至40℃再加入2.9 g 維生素C，并充分攪拌后降低至室溫備用[25]。羽化后成蟲飼喂浸漬于脫脂棉球上的10%蔗糖溶液，用載玻片作為產(chǎn)卵基質(zhì)。

1.2 玉米品種

供試品種為“浚單20”，購于河南秋樂種業(yè)有限公司。播種于田間防蟲網(wǎng)內(nèi)的花盆中，每盆種植1株，以避免其他害蟲取食以及不同玉米植株根系之間的相互作用對丁布合成量的潛在影響。大喇叭口期時，將被試植株連同花盆轉(zhuǎn)移到隔離的小網(wǎng)室中，選取苗高和葉片面積大致一致的植株，進行外源因素的誘導(dǎo)處理。

1.3 供試試劑

磷酸、乙醚、甲醇、無水乙酸購買于天津科密歐公司，色譜純，純度均在99.5%以上。丁布標樣在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用昆蟲生態(tài)學(xué)實驗室提取和分離，并在鄭州大學(xué)分析測試中心采用Agilent 1200/6220高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢驗純度。

1.4 玉米葉片誘導(dǎo)

為了探討亞洲玉米螟取食玉米葉時物理因子和化學(xué)因子的相對影響，設(shè)置下述3組處理。(1)昆蟲取食組。取人工飼料飼養(yǎng)的亞洲玉米螟4齡幼蟲，用軟毛刷接于玉米心葉處。分為1、2、3頭·株-13個水平；每種取食處理的誘導(dǎo)時間均分5個水平，即誘導(dǎo)3、6、12、24、48 h。昆蟲釋放之后用透明塑料圓筒罩住每盆玉米，一是防止幼蟲逃逸，二是防止不同植株之間的氣味通訊，三是盡量使生長環(huán)境接近自然。(2)機械損傷組。亞洲玉米螟為害造成“排孔”癥狀，故用0.4 cm ID打孔器對玉米苗上部第2片葉做打孔處理，模擬為害所致機械損傷。試驗設(shè)計基本同上，差別僅在于用葉片打孔的方式代替釋放幼蟲。打孔數(shù)也分為3個水平，即在葉脈兩側(cè)分別打4、6、8個圓孔(圓孔直徑為0.4 cm)。其中，葉脈每側(cè)打4個圓孔的處理，圓孔均在一排上；葉脈每側(cè)打6個圓孔和8個圓孔的處理，圓孔分為2排，間距大約4 cm。預(yù)試驗表明，這些圓孔所致?lián)p傷葉面積分別相當于幼蟲在1、2、3頭·株-1釋放密度下48 h取食的葉面積。(3)模擬取食組。該組的目的是將取食物理因子(蛀孔)和化學(xué)因子(口器反吐液)疊加，并與上述2組丁布含量指標對比。幼蟲反吐液收集方法是，在體視解剖鏡下用鑷子輕壓5齡幼蟲胸部背面，用1.0 mm內(nèi)徑的毛細管收集反吐液，立刻吹入1.5 mL離心管，多次收集合并的反吐液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗設(shè)計基本同上述2組，差別在于葉片打孔后，每個孔周圍用移液器均勻涂抹幼蟲反吐液2.0 μL。另外，在相同生態(tài)環(huán)境中各設(shè)置1組對照植株，用于化學(xué)分析采樣的對照植株與不同取食誘導(dǎo)時間相對應(yīng)。

1.5 丁布提取和分析

對上述不同誘導(dǎo)處理的玉米葉片進行丁布含量分析。為了避免離體葉片自發(fā)性代謝變化，野外采集葉片之后，迅速置于獨立的冰盒中攜帶到室內(nèi)，馬上進行丁布提取和色譜分析。

丁布提取方法在WOODWARD等[26]方法的基礎(chǔ)上改進，主要改進點是用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值以便提高丁布得率。首先，以亞洲玉米螟取食痕跡或打孔器所致?lián)p傷位置為中心，取玉米葉片樣品1 g，加少許蒸餾水研磨勻漿，室溫靜置15 min。然后，在Hanna Hi98128筆式酸度計的實時監(jiān)測下，用0.1 mol·L-1磷酸溶液將pH值調(diào)節(jié)至3.0，轉(zhuǎn)移至5.0 mL的離心管中，在12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min。最后用移液器取出上清液，每次用等體積乙醚萃取，共萃取3次，在Heidolph-4011型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(熱源溫度40 ℃)上蒸干乙醚，溶于甲醇并過0.45 μm濾膜，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用配置C18柱(150 mm × 4.6 mm)的Agilent 1200/6220高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定丁布含量。進樣量10 μL，柱溫28 ℃，流動相為體積比為1∶1的甲醇與0.5%乙酸溶液，柱流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為262 nm。將色譜峰保留時間、紫外光譜與丁布標樣對比。外標法定量，以不同濃度丁布標樣的吸收峰面積作出標準曲線，計算不同樣品中丁布含量，以每克鮮組織中含有的丁布表示(μg·g-1)。誘導(dǎo)處理類型×損傷強度(打孔數(shù)或昆蟲釋放頭數(shù))×誘導(dǎo)時間的每個組合重復(fù)3次，各組配置的對照也重復(fù)3次，共144份樣品。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 for Windows的一般線性模型(General linear model)統(tǒng)計。首先，采用三因素方差分析比較不同類型的外源因素誘導(dǎo)因子對玉米葉中丁布含量的影響。由于昆蟲取食組玉米葉片被食葉面積隨誘導(dǎo)時間延長逐漸增大，而機械損傷組和模擬取食組葉損傷面積是定值。因此，統(tǒng)一以有序變量“損傷強度”表示，分為“輕度受損”“中度受損”和“嚴重受損”3個等級，和相應(yīng)幼蟲釋放頭數(shù)和打孔數(shù)對應(yīng)。該模型自變量為外源誘導(dǎo)因子類型(名義變量)、誘導(dǎo)時間(連續(xù)變量)和損傷強度(有序變量)，考察所有因素主效應(yīng)和二階交互效應(yīng)。此外，通過3組二因素方差分析更詳細地探明昆蟲取食組、機械損傷組和模擬取食組各組內(nèi)部不同處理條件的具體影響，昆蟲取食組的自變量為試蟲釋放頭數(shù)和誘導(dǎo)時間，其他2組的自變量為打孔數(shù)和誘導(dǎo)時間。多重比較采用Student-Newman-Keuls法，顯著性水平取α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源誘導(dǎo)因素對玉米葉片丁布含量的影響

外源誘導(dǎo)因子類型對玉米葉片中丁布含量有極顯著影響(F2,114=31.87，P<0.000 1)，其他2個主效應(yīng)的影響也達到顯著水平(誘導(dǎo)時間：F4,114=3.03，P=0.020 5；損傷強度：F2,114=4.55，P=0.012 6)，誘導(dǎo)因子類型和誘導(dǎo)時間之間存在極顯著交互(F8,114=5.77，P<0.000 1)。損傷強度和另外兩個因素之間則均不存在顯著交互作用(損傷強度×誘導(dǎo)因子類型：F4,114=2.15，P=0.079 2；損傷強度×誘導(dǎo)時間：F8,114=0.91，P=0.514 4)。

3種因素主效應(yīng)的多重比較如表1所示。誘導(dǎo)因子類型比較中，機械損傷組玉米葉片中丁布含量最高為(492.39±53.00)μg·g-1，且顯著高于其他3組；對照組丁布含量為最低(419.55±30.53)μg·g-1，且顯著低于其他3組；昆蟲取食組和模擬取食組的玉米葉片含量居中且無顯著性差異。受損傷玉米葉片丁布含量均顯著高于健康玉米葉片，但與受損程度無關(guān)；類似地，各誘導(dǎo)處理時間的玉米葉片丁布含量均顯著高于對照，但凡是經(jīng)過外源因素誘導(dǎo)之后的葉片，丁布含量均與誘導(dǎo)時長無關(guān)。

表1 外源誘導(dǎo)因素的不同水平對玉米葉中丁布含量的影響Table 1 Effect of different levels of exogenous induction factors on DIMBOA content in maize leaves

注：平均丁布含量一列中，不同小寫字母表示相同比較對象內(nèi)各水平之間的差異顯著(P<0.05)。

Note: In the column of mean DIMBOA content,the lowercase letters attached to the numbers indicate significant difference between levels within the same object for multiple comparison(P<0.05).

2.2 亞洲玉米螟取食對玉米葉片丁布含量的影響

亞洲玉米螟釋放頭數(shù)(F2,32=0.41，P=0.670 3)和取食誘導(dǎo)時間(F4,32=2.48，P=0.063 8)對玉米葉片丁布含量均無顯著影響，二者也不存在顯著交互(F8,32=0.08，P=0.999 5)，無需多重比較。

2.3 機械損傷對玉米葉片丁布含量的影響

機械損傷組中，誘導(dǎo)時間對玉米葉片中丁布含量有極顯著影響(F(4,32)=7.96，P=0.000 1)，打孔損傷程度的影響也達到了顯著水平(F(4,32)=5.09，P=0.012 0)，但二者不存在顯著交互(F(4,32)=0.66，P=0.723 4)。多重比較表明，打孔數(shù)效應(yīng)的顯著性主要表現(xiàn)在葉片打孔與非打孔方面，而不是打孔數(shù)量(表2)。誘導(dǎo)時間是機械損傷組中影響玉米葉中丁布含量的主要因素，機械損傷后6 h內(nèi)丁布含量差異不顯著，丁布合成高峰在機械損傷誘導(dǎo)12 h后逐漸下降(表2)。

表2 機械損傷后不同誘導(dǎo)時間和損傷強度對玉米葉中丁布含量影響的多重比較Table 2 SNK multiple range test of DIMBOA content in maize leaves exposed to mechanical damage

注：本表為誘導(dǎo)時間和打孔數(shù)(損傷強度)兩個主效應(yīng)的多重比較結(jié)果。分析誘導(dǎo)時間時，相同時間點不同打孔數(shù)誘導(dǎo)的丁布含量數(shù)據(jù)合并分析；相應(yīng)地，分析損傷強度時，相同打孔數(shù)不同誘導(dǎo)時間的丁布含量數(shù)據(jù)合并分析。取樣到上機分析的時滯最多1 h。平均丁布含量一列中，數(shù)字之后的小寫字母表示相同比較對象內(nèi)各水平之間的差異顯著性。

Note: This table indicates the multiple-range comparison of two main factors (Induction time and Hole number).When the effect of induction time was analyzed,the DIMBOA content data from maize leaves induced with different hole numbers at the same time point were merged for analysis; correspondingly,when the effect of hole number was analyzed,the DIMBOA content data from maize leaves induced with the same hole number at different times were merged for analysis.The time lag from sample collection to chemical analysis is not longer than 1 h.In the column of mean DIMBOA content,the lowercase letters attached to the numbers indicate significant difference between levels within the object for multiple comparison.

2.4 模擬取食對玉米葉片丁布含量的影響

在機械打孔處添加亞洲玉米螟反吐液后，丁布含量表現(xiàn)出和正常昆蟲取食組相似的模式，誘導(dǎo)時間(F(4,32)=0.55，P=0.699 9)、打孔數(shù)(F(2,32)=1.10，P=0.344 5)及二者交互作用(F(8,32)=0.51，P=0.842 7)均不顯著，無需多重比較。

2.5 不同外源誘導(dǎo)因素對玉米葉片丁布含量影響的時相分析

從圖1可以看出，玉米葉片對不同外源因子誘導(dǎo)的短期反應(yīng)(0～6 h)，均是小幅增加了丁布合成量。然而，隨著誘導(dǎo)時間延長，玉米對3類外源誘導(dǎo)因子的響應(yīng)模式明顯不同。機械損傷造成丁布含量大幅上升，12 h時達到頂峰，隨后緩慢衰減，一直到試驗設(shè)計的最大誘導(dǎo)時間(48 h)時仍比其他2組丁布含量高。而昆蟲取食組和模擬取食組響應(yīng)模式相似，被誘導(dǎo)玉米葉片丁布含量從玉米短期反應(yīng)期(3 h)過后，一直維持在和對照無顯著差異的水平。不同點在于，昆蟲取食組丁布含量緩慢上升，而模擬取食組丁布含量緩慢下降。

圖1 不同外源因素類型與誘導(dǎo)時間的交互作用分析Fig.1 Interaction analysis of different types of exogenous induction factors and induction times

3 結(jié)論與討論

大田玉米品種丁布含量與抗螟性關(guān)系的數(shù)據(jù)，不能確定是成蟲寄主選擇過程的差異所致，還是幼蟲取食造成特定植株丁布含量變化所致[9]，而另一些研究是將丁布或結(jié)構(gòu)類似物定量混入人工飼料進行測試[3,8,10,12,15]，難以弄清玉米和亞洲玉米螟之間的適應(yīng)和反適應(yīng)對策。通過研究機械損傷、昆蟲取食和模擬取食對玉米葉片丁布含量的影響，表明誘導(dǎo)因素類型占主導(dǎo)作用，誘導(dǎo)時間和損傷強度從屬于前者發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明，只有機械損傷刺激丁布大量合成，誘導(dǎo)后12 h達到高峰，然后逐漸下降。亞洲玉米螟取食并不會誘導(dǎo)丁布合成量大幅增加，相反，會起到顯著抑制作用。

亞洲玉米螟幼蟲所蛀孔徑隨著持續(xù)取食逐漸擴大，盡管打孔器孔徑0.4 cm盡量模擬“排孔”，仍不能排除“一次性損傷”和“逐漸損傷”造成玉米應(yīng)激反應(yīng)速度的差異，單純比較昆蟲取食組和機械損傷組也許會得出這樣的結(jié)論。然而，模擬取食組是用相同打孔器處理的，不同點僅在于每孔周圍涂布了20 μL幼蟲反吐液，就造成該組和機械損傷組丁布生物合成模式的顯著差異，而和昆蟲取食組丁布合成模式相似。因此，可以認為是亞洲玉米螟幼蟲反吐液抑制了丁布合成。由于昆蟲取食組和模擬取食組內(nèi)部也設(shè)置了對照植株，但昆蟲釋放頭數(shù)、打孔數(shù)和誘導(dǎo)時間等都不影響丁布含量，故幼蟲反吐液能夠?qū)⒍〔己铣闪烤S持在“正?！彼缴稀Ａ硗?，昆蟲取食組丁布含量緩慢上升，而模擬取食組丁布含量緩慢下降，可能是由于實際取食存在著玉米葉受損面積逐漸增加的過程。因此，丁布并非亞洲玉米螟幼蟲為害誘導(dǎo)產(chǎn)生的玉米防衛(wèi)物，而是玉米在各種脅迫下自發(fā)合成的[19-20]。健康幼苗不能檢測到游離的丁布，只存在穩(wěn)定的β-葡萄糖苷鍵合物[27]，本研究發(fā)現(xiàn)機械損傷是玉米苗丁布合成的主要誘導(dǎo)因素，這與CAMBIER等[27]的結(jié)論一致。然而，也有報道玉米受到亞洲玉米螟[18]、西南玉米桿草螟[28]、歐洲玉米螟[29]危害后丁布含量顯著增加，可能是由于沒有將昆蟲取食按照誘導(dǎo)時間系統(tǒng)展開研究造成的。

自然界中昆蟲面臨著大量時空異質(zhì)性分布的植物防衛(wèi)物，對植物化合物抗性的程度和本質(zhì)隨著植物基因型的地理分布、植物-昆蟲關(guān)系的特異性、局部生態(tài)成分而變化。昆蟲適應(yīng)植物防衛(wèi)物的機制包括嗅覺和味覺回避、排泄、儲存、解毒和靶標突變等[30]。玉米鱗翅目害蟲適應(yīng)機制已有報道。玉米心葉中的刺激取食劑會掩蔽丁布對亞洲玉米螟的拒食效果[8]，類似報道是南方灰翅夜蛾[14]。亞洲玉米螟[6]和東方粘蟲Mythimnaseparate(Walker)[31]消化道中存在的尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶或其他尿苷二磷酸葡萄糖依賴性酶可以快速將丁布降解為無毒產(chǎn)物，而歐洲玉米螟可以通過排泄的調(diào)控將組織中的丁布濃度和蟲糞中的濃度比穩(wěn)定在0.25左右[32]。

鱗翅目幼蟲反吐液的功能也已有報道。鱗翅目幼蟲取食植物伴隨的反吐液影響受害植物與后繼植食者之間的相互作用[33]。甜菜夜蛾幼蟲反吐液中分離出一種被稱為“Volicitin”的物質(zhì)也能夠吸引天敵[34]。然而，鱗翅目幼蟲反吐液對植物非揮發(fā)性次生防衛(wèi)物合成的影響少有報道，本研究探索了鱗翅目幼蟲利用反吐液從植物防衛(wèi)物生物合成源頭上適應(yīng)寄主的新機制。