王錦淳，王 蕾，嵇月娥，閔學(xué)文，陳朱井

0 引 言

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是高脂血癥的一種類型，以血漿三酰甘油水平升高為特征，是體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的結(jié)果。高甘油三酯血癥患者不僅動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)增加，還與多種嚴(yán)重疾病如心腦血管疾病、糖尿病、腎疾病等密切相關(guān)[1]。研究顯示中國(guó)人血脂代謝紊亂以三酰甘油 (triglyceride，TG)升高最為常見，高甘油三酯血癥發(fā)病率是高膽固醇血癥發(fā)病率的4倍[2]。貝特類藥物如非諾貝特在治療高甘油三酯血癥過程中具有良好的療效，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起肝損傷、肌炎以及橫紋肌溶解等不良反應(yīng)[3]。本研究以高脂飼料法建立的高甘油三酯血癥模型大鼠為載體，觀察黃芩莖葉總黃酮(scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid，SSTF)對(duì)高甘油三酯血癥大鼠脂代謝及氧化應(yīng)激水平的影響，期望為黃芩莖葉總黃酮的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，8周齡，體重(180.00±10.00) g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(蘇)2016-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)期間光照明暗交替周期為12 h，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.1.2 主要試劑與儀器 非諾貝特片(批號(hào)20170818)購自上海衡山藥業(yè)有限公司，SSTF粉末(批號(hào)010406)由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，含量以總黃酮計(jì)61.80 %。非諾貝特片劑以95 %乙醇助溶后加入純水制備成10 mg/mL溶液，SSTF粉末以0.1 mol/L NAOH助溶后加入純水制備成10 mg/mL 溶液。TG(批號(hào)20171018)、TC(批號(hào)20171021)、LDL-C(批號(hào)20171018)、HDL-C(批號(hào)20171015)、丙二醇(批號(hào)20171123)、SOD(批號(hào)20171123)及GSH-PX(批號(hào)20171125)測(cè)試盒均購自南京建成生物研究所。BP110S電子秤(德國(guó)SARTORIUS公司)、TL-16G型高速冷凍離心機(jī)(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)、UV-1240型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、CKX41倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高脂模型及給藥方法 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，完全隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常組、模型組、非諾貝特組，以及SSTF低、中、高劑量組，每組10只。除正常組，其余組大鼠制備高甘油三酯血癥模型[4]。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、非諾貝特組以及SSTF低、中、高劑量組給予高脂飼料(15%純豬油、0.2%膽固醇、10%蛋黃粉及74.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，每日定量喂食，共6周。造模的同時(shí)給予藥物干預(yù)，非諾貝特組給予非諾貝特100 mg/kg，SSTF低、中、高劑量組分別給予50、100、200 mg/kg SSTF，正常組和模型組均給予等量的等滲鹽水，按照標(biāo)準(zhǔn)給藥體積10 mL/kg計(jì)算，灌胃， 1次/d，連續(xù)給藥6周。給藥期間分別于實(shí)驗(yàn)開始時(shí)以及第2、4、6周記錄體重量變化情況[5]。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，檢測(cè)TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；藥物干預(yù)6周，末次給藥后禁食不禁水12 h，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C；摘取大鼠肝后準(zhǔn)確稱重，記錄肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)，公式如下：

肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%[6]

肝取部分漂洗、研磨、制勻，離心，取上清，測(cè)定TG、TC、丙二醇、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)，其余4%多聚甲醛溶液固定備用。

1.2.3 肝組織病理學(xué)觀察 肝組織多聚甲醛浸泡固定24 h，按步驟脫水，包埋，切片，HE染色，封固。顯微鏡下觀察正常組、模型組、非諾貝特組、SSTF低、中、高劑量組肝組織之間的病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 SSTF對(duì)各組大鼠體重與肝指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠2～6周體重顯著增加(P<0.05)，同時(shí)肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，非諾貝特組、SSTF低、中、高劑量組大鼠體重增長(zhǎng)量及肝指數(shù)均明顯降低(P<0.05)；與非諾貝特組相比，SSTF高劑量組大鼠4～6周體重明顯降低(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果顯示SSTF能有效降低高甘油三酯血癥大鼠體重和肝指數(shù)的增長(zhǎng)。見表1。

2.2 SSTF對(duì)各組大鼠血脂水平的影響 第6周，與正常組相比，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，非諾貝特組、SSTF低、中、高劑量組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)；與非諾貝特組相比，SSTF高劑量組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果顯示SSTF能有效降低高甘油三酯血癥大鼠血清TG、TC、LDL-C水平，升高高甘油三酯血癥大鼠血清HDL-C水平。見表2。

組別體重(g)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)2周4周6周6周肝指數(shù)(%)正常組179.40±4.90211.60±12.06233.10±12.56249.70±12.963.02±0.49模型組180.80±5.73237.80±13.81*279.20±20.36*317.90±30.49*4.86±0.40*非諾貝特組182.80±4.54207.30±14.04#229.00±16.57#241.80±17.05#3.82±0.29#SSTF低劑量組178.00±6.11210.80±12.32#222.00±12.88#237.70±15.15#3.65±0.36#SSTF中劑量組180.70±6.85202.60±10.09#216.90±11.58#229.50±12.51#3.55±0.39#SSTF高劑量組178.50±5.87200.10±12.68#215.20±12.44#△226.40±15.13#△3.51±0.32#△

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與非諾貝特組比較，△P<0.05

組別TG實(shí)驗(yàn)開始時(shí)6周TC實(shí)驗(yàn)開始時(shí)6周HDL-C實(shí)驗(yàn)開始時(shí)6周LDL-C實(shí)驗(yàn)開始時(shí)6周正常組0.67±0.070.69±0.042.26±0.252.32±0.201.25±0.101.23±0.120.37±0.090.35±0.07模型組0.67±0.061.79±0.18*2.27±0.226.21±0.41*1.23±0.110.73±0.10*0.35±0.060.82±0.14*非諾貝特組0.68±0.050.74±0.08#2.33±0.234.39±0.42#1.25±0.111.17±0.10#0.36±0.070.44±0.10#SSTF低劑量組0.67±0.050.80±0.10#2.33±0.254.29±0.44#1.26±0.101.18±0.11#0.36±0.060.41±0.06#SSTF中劑量組0.66±0.050.76±0.09#2.23±0.194.16±0.47#1.22±0.101.21±0.10#0.35±0.080.38±0.08#SSTF高劑量組0.67±0.060.67±0.07#△2.32±0.223.95±0.37#1.24±0.121.23±0.11#△0.35±0.080.36±0.06#△

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與非諾貝特組比較，△P<0.05

2.3 SSTF對(duì)各組大鼠肝脂水平的影響 藥物干預(yù)第6周，與正常組相比，模型組大鼠肝組織TG、TC水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，SSTF低、中、高劑量組大鼠肝組織TG、TC水平顯著降低(P<0.05)；與非諾貝特組相比，SSTF高劑量組大鼠肝組織TG水平顯著降低(P<0.05)，但TC水平降低不明顯(P>0.05)。結(jié)果顯示SSTF能有效降低高甘油三酯血癥大鼠肝組織TG、TC水平。見表3。

組別TGTC正常組0.55±0.121.36±0.18模型組1.60±0.15*3.47±0.36*非諾貝特組0.86±0.14#1.93±0.26#SSTF低劑量組0.79±0.15#2.02±0.27#SSTF中劑量組0.74±0.17#1.90±0.22#SSTF高劑量組0.72±0.14#△1.82±0.20#

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與非諾貝特組比較，△P<0.05

2.4 SSTF對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 藥物干預(yù)第6周，與正常組相比，模型組大鼠肝丙二醇含量顯著增加(P<0.05)，SOD活性、GSH-PX活力顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，非諾貝特組、SSTF低、中、高劑量組大鼠肝臟丙二醇含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性、GSH-PX活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與非諾貝特組相比，SSTF高劑量組大鼠肝臟丙二醇含量顯著減少(P<0.05)，SOD活性、GSH-PX活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)果顯示黃芩莖葉總黃酮能有效改善高甘油三酯血癥大鼠的氧化損傷。見表4。

組別丙二醇(nmol/mg)SOD(U/mg)GSH-PX(U/mg)正常組4.81±1.12206.72±29.4015.58±1.56模型組10.29±1.98*106.84±24.01*9.28±2.08*非諾貝特組6.21±1.06#142.45±32.02#12.52±1.74#SSTF低劑量組6.19±1.03#134.14±26.06#12.35±1.88#SSTF中劑量組5.71±1.21#156.81±31.47#13.40±1.99#SSTF高劑量組5.07±1.31#△172.21±30.21#△14.62±2.42#△

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與非諾貝特組比較，△P<0.05

2.5 SSTF對(duì)各組大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 肝組織病理結(jié)果顯示，正常組肝小葉形態(tài)正常，肝索排列整齊，細(xì)胞大小均勻，核大而圓；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積腫脹，伴大量脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，部分水樣變性；非諾貝特組、SSTF低、中、高劑量組大鼠肝組織學(xué)變化介于正常組和模型組之間，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，伴不同程度肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞核大小不一，其中以SSTF高劑量組鏡下改善最為明顯，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，伴少量脂肪變性。見圖1。

a：正常組；b：模型組；c：非諾貝特組；d：SSTF低劑量組；e：SSTF中劑量組；f：SSTF高劑量組

圖 1 SSTF對(duì)各組大鼠肝組織病理形態(tài)的影響(HE ×200)

Figure 1 Effects of SSTF on liver pathomorphology of rats in each group(HE ×200)

3 討 論

國(guó)內(nèi)外研究表明，高甘油三酯血癥可通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vassel smooth muscle cells,VSMCs)增殖、促進(jìn)血栓形成等多種途徑啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化[7-10]。在高甘油三酯血癥致脂代謝紊亂誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的過程中，氧化應(yīng)激起著非常重要的作用[11]。丙二醇、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)，丙二醇是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度；SOD是機(jī)體清除自由基最為重要的抗氧化酶，其活性反映機(jī)體抗氧化能力；GSH-PX存在于細(xì)胞質(zhì)中，主要通過促進(jìn)過氧化脂質(zhì)的分解，有效清除機(jī)體內(nèi)自由基，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)[12]。因此，本文選取SOD、丙二醇、GSH-PX作為檢測(cè)指標(biāo)，觀察不同組別大鼠氧化應(yīng)激水平的變化，研究結(jié)果表明，模型組大鼠肝丙二醇含量顯著增加，SOD活性、GSH-PX活力顯著降低，說明高甘油三酯血癥大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂代謝紊亂，降低氧化應(yīng)激水平，將有助于改善高甘油三酯血癥大鼠的脂代謝紊亂。

黃芩是傳統(tǒng)中藥材，唇形科植物，藥用其根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用。黃芩莖葉是黃芩的地上部分，其化學(xué)成分包括野黃芩苷、黃芩苷等，其提取物的有效部位即為黃芩莖葉總黃酮，屬于黃酮類化合物。大多數(shù)黃酮類化合物均具有抗氧化作用[13-15]，SSTF也不例外。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SSTF能顯著提高過氧化氫損傷的心肌細(xì)胞的存活率[16]，提高原代培養(yǎng)肝細(xì)胞損傷大鼠血清SOD活性[17]，改善鋁中毒小鼠的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷[18]，增強(qiáng)阿爾茨海默病大鼠血清SOD活性、CAT含量和GSH-PX活性，保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)元和突觸超微結(jié)構(gòu)損傷[19-20]。課題前期研究表明，SSTF對(duì)心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護(hù)作用，能夠抑制高甘油三酯血清刺激的VSMCs增殖[21]，并對(duì)過氧化氫及高甘油三酯血清誘導(dǎo)的HUVEC氧化損傷具有保護(hù)作用[12,22-23]。

本研究以高脂飼料法制備的高甘油三酯血癥模型大鼠為研究對(duì)象，給予不同劑量的SSTF干預(yù)，通過測(cè)量大鼠體重、肝指數(shù)，測(cè)定血脂譜指標(biāo)TG、TC、LDL-C、HDL-C，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、丙二醇、GSH-PX，HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，并與陽性藥物非諾貝特組進(jìn)行比較，從整體動(dòng)物水平觀察SSTF對(duì)高甘油三酯血癥大鼠脂代謝及氧化應(yīng)激水平的影響。研究結(jié)果表明，各劑量組SSTF均能減輕高甘油三酯血癥大鼠的體重、肝指數(shù)，降低血清及肝臟TG、TC水平，降低血清LDL-C水平，升高血清HDL-C水平，減少丙二醇表達(dá)，增加SOD、GSH-PX表達(dá)，與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組SSTF可顯著降低大鼠血清TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，降低大鼠肝TG水平，減少丙二醇表達(dá)，增加SOD、GSH-PX表達(dá)，與非諾貝特組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，提示SSTF調(diào)血脂和抑制氧化應(yīng)激作用以高劑量組尤為明顯；肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，各劑量組SSTF均能改善高甘油三酯血癥導(dǎo)致的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積腫脹，脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)及部分水樣變性等肝臟病理性損傷，其中以SSTF高劑量組鏡下改善最為明顯，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，伴少量脂肪變性。

綜上所述，本研究的相關(guān)結(jié)果表明，SSTF具有調(diào)節(jié)高甘油三酯血癥大鼠脂代謝，改善肝臟病理性損傷的作用，該作用可能與抑制脂質(zhì)過氧化、減少氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。