張艷雯，張鶴曦，覃 靜，周晴云，唐子瓊

(1.南寧學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.欽州市畜牧站，廣西 欽州 535099)

【研究意義】白細胞介素2(IL-2)是一種由激活T淋巴細胞產(chǎn)生的生長因子，也是CD4+和CD8+效應(yīng)T細胞增殖和分化的關(guān)鍵因子[1-3]，可通過誘導(dǎo)細胞毒性T細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞及自然殺傷細胞促進T細胞產(chǎn)生的相關(guān)細胞因子表達，特異性增強細胞免疫反應(yīng)[4]。白細胞介素18(IL-18)是由激活的單核細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子[5]，具有誘導(dǎo)NK細胞或絲裂原激活T細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，同時提高NK細胞和T細胞殺傷活性[6-7]，在提高機體抗感染能力和識別、清除異化自體組織等方面發(fā)揮重要作用[8]。IL-2或IL-18在人體及其他動物上具有廣泛的生物學(xué)活性和應(yīng)用價值[9-11]，通過原核和真核表達載體制備獲得的DNA疫苗可明顯增強疫苗的免疫原性[12-14]。雞白細胞介素2(ChIL-2)和雞白細胞介素18(ChIL-18)蛋白具有重要的生物學(xué)功能，但二者的表達量因試驗方法及條件的不同存在明顯差異。因此，加強ChIL-2和ChIL-18研究對其蛋白功能、生物學(xué)活性及聯(lián)合應(yīng)用免疫佐劑的研發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Sundick等[15]用ConA刺激活化的雞脾臟細胞，通過轉(zhuǎn)染COS-7細胞，首次克隆獲得ChIL-2基因，并篩選出T細胞增殖活性。KaiserI等[16]采用RACE克隆獲得ChIL-2全序列，并對其進行基因組結(jié)構(gòu)分析和染色體定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與哺乳動物極相似，且存在其他潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。張春杰等[17]從雞新城疫Ⅰ系疫苗誘導(dǎo)的雞胚脾淋巴細胞中擴增獲得ChIL-2全長cDNA序列，將ChIL-2基因克隆到原核表達載體上，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明所克隆的ChIL-2基因在大腸桿菌中得到良好表達。郭川等[18]從雞脾臟細胞中擴增出ChIL-2編碼基因，將該編碼基因克隆至原核表達載體并構(gòu)建了ChIL-2基因的重組原核表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后經(jīng)誘導(dǎo)表達，分別得到兩種表達產(chǎn)物，經(jīng)過純化復(fù)性后，表達產(chǎn)物具有明顯促進雞脾淋巴細胞增殖的作用。Schneider等[19]首次從脂多糖(LPS)刺激的雞巨噬細胞系HD-11中擴增并克隆獲得ChIL-18基因。Kaiser等[20]報道顯示，火雞與雞的IL-18基因的編碼區(qū)高度保守，具有很高的同源性，系統(tǒng)進化樹分析表明二者的IL-18在生物學(xué)活性上有交叉反應(yīng)。胡敬東等[21]從LPS刺激10 h活化的MDCC-MSB1細胞中克隆獲得ChIL-18成熟活性蛋白的完整基因片段，完成了原核和真核表達。李宏梅等[22]研究發(fā)現(xiàn)，利用原核表達的重組雞rChIL-18蛋白具有提高NK細胞和CTL殺傷活性作用?！颈狙芯壳腥朦c】隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，ChIL-2和ChIL-18基因與功能已成為研究的熱點，但針對ChIL-2和ChIL-18蛋白表達的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)GenBank中ChIL-2和ChIL-18基因序列設(shè)計并合成特異性引物，采用RT-PCR擴增ChIL-2和ChIL-18基因，并克隆到pET32a原核載體和pVAX1真核載體上，分別構(gòu)建原核表達載體pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18及真核表達載體pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18，分別以Western blotting檢測確定該蛋白表達量及間接熒光檢測ChIL-2和ChIL-18蛋白在細胞中的表達量，為后續(xù)ChIL-2和ChIL-18蛋白功能、生物學(xué)活性及聯(lián)合應(yīng)用免疫佐劑的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種和克隆載體 大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞、大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞、pET32a原核表達載體、pET28a原核表達載體、pVAX1真核表達載體和pMD19-T 載體購自大連寶生物工程TaKaRa公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 小型臺式離心機、低溫高速離心機、移液槍、天平、pH計、電熱恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、高壓滅菌鍋、脫色搖床、多用途旋轉(zhuǎn)搖床、制冰機、核酸電泳儀、電泳槽、蛋白電泳儀、PCR儀、水浴鍋、超聲波細胞破碎機和凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 工具酶和試劑 OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒、OMEGA質(zhì)粒大提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、常規(guī)限制性內(nèi)切酶(KpnⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、MluⅠ和XbaⅠ)、PCR用DNA聚合酶(Taq酶)、蛋白Marker、dATP(R0141)、T4DNA連接酶、DNA Marker、dNTPs、酵母提取物、NaCl、胰蛋白胨、磷酸鹽緩沖液、甘氨酸、Tris堿、甲醇、刀豆蛋白A和四甲基偶氮唑鹽。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank已公布的ChIL-2(GU119890.1)和ChIL-18(NM_204608.1)基因序列，應(yīng)用Primer 7.0設(shè)計擴增ChIL-2和ChIL-18基因的特異性引物(表1)，引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 無特定病原(SPF)雞脾淋巴細胞分離培養(yǎng)及總RNA提取 30日齡SPF雛雞購自九江博美萊生物制品有限公司。在無菌條件下，取雞脾臟后制成單細胞懸液，400 r/min離心15 min，將離心沉淀的細胞懸浮于含10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，取一支新的離心管，先加入4 mL淋巴細胞分離液，再加入等體積的淋巴細胞懸液，用密度梯度離心法，400 r/min離心15 min，分離淋巴細胞；再用RPMI1640培養(yǎng)液在350 r/min離心條件下離心洗滌淋巴細胞2次后，用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整至1×107個/mL，并加至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL，置于40 ℃、5 % CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的第6和20 h收集培養(yǎng)細胞，于4 ℃下400 r/min條件下離心15 min，用1 mL RPMI1640培養(yǎng)液重新懸浮細胞，用TRIzol試劑提取淋巴細胞總RNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。提取的淋巴細胞總RNA置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 擴增ChIL-2和ChIL-18基因的特異性引物

1.2.3 ChIL-2和ChIL-18基因克隆與鑒定 用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo(dT)15引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，采用表1中引物分別進行PCR擴增，擴增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s ，進行33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1 %瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，參考DNA膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物，分別獲得ChIL-2 和ChIL-18基因片段。將回收的ChIL-2和ChIL-18基因片段分別克隆到pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細胞。參考OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒說明分別小量提取重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18后，選擇合適的酶切位點進行酶切鑒定和測序。

1.2.4 ChIL-2和ChIL-18基因原核表達 以重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18為模板，用表2中引物分別進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行膠回收，獲得純化的ChIL-2和ChIL-18基因片段。用BamH I和SalⅠ分別雙酶切pET32a和pET28a載體。在22 ℃水浴條件下，用T4 DNA連接酶將ChIL-2基因片段與載體pET32a、ChIL-18基因片段與載體pET28a進行連接反應(yīng)4 h，并轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細胞。將感受態(tài)細胞涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑選單個菌落，接種至2 mL LB液體培養(yǎng)液中，置于37 ℃氣浴搖床中振蕩培養(yǎng)。參考OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒說明對菌液進行質(zhì)粒小量提取，得到陽性重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18，分別用PCR和雙酶切鑒定并測序。將重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18轉(zhuǎn)化至BL21中感受態(tài)細胞，涂板后37 ℃過夜。次日挑取單個菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，待菌液濃度A600=1.5時，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。取部分菌液進行SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定。

表2 構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18的引物

表3 構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18的引物

1.2.5 ChIL-2和ChIL-18基因真核表達 以重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18為模板，用表3中的引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收，獲得純化的ChIL-2和ChIL-18基因片段。用KpnI和XbaI雙酶切pVAX1載體，在22 ℃水浴條件下，用T4DNA連接酶將ChIL-2和ChIL-18基因片段與pVAX1載體進行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細胞，將感受態(tài)細胞涂板后37 ℃過夜培養(yǎng)。參照OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒說明少量提取質(zhì)粒，分別獲得重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18。將重組真核表達質(zhì)粒分別進行PCR、酶切鑒定和測序。將重組真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎(Vero)細胞，24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察其蛋白表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChIL-2和ChIL-18基因克隆結(jié)果

2.1.1 ChIL-2和ChIL-18基因PCR擴增結(jié)果 從圖1的1和2泳道可見1條清晰特異性條帶，其中，1泳道的條帶約在400 bp處，2泳道的條帶約在600bp處，與預(yù)測的目的基因片段大小相符。

M：DNA Marker；1：ChIL-2；2：ChIL-18

2.1.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18酶切鑒定結(jié)果 對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2和pMD19-T-ChIL-18經(jīng)BamH I和SalI雙酶切，結(jié)果顯示，1和2泳道的目的條帶大小與預(yù)測結(jié)果相符(圖2)。

2.1.3 ChIL-2和ChIL-18基因的測序 測序結(jié)果顯示，ChIL-2和ChIL-18基因片段全長分別為429和593 bp，采用DNASTAR對其核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChIL-2基因片段編碼143個氨基酸，ChIL-18基因片段編碼218個氨基酸殘基。與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的雞IL-2(Sequence ID：AAC96064.1)和IL-18(Sequence ID：NP_989939.1)序列進行比對，其相似性分別為99.7 %和100.0 %(圖3～4)。

M：DNA Marker；1：重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-2；2：重組質(zhì)粒pMD19-T-ChIL-18

2.2 ChIL-2和ChIL-18蛋白的原核表達情況

2.2.1 重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18鑒定結(jié)果 選擇PstI對構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2進行酶切，選擇MluI和SalI對構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18進行酶切。從圖5可看出，酶切獲得的目的條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符；測序結(jié)果也表明，構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒正確，無基因突變，即已成功構(gòu)建獲得重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18。

1：ChIL-2基因編碼區(qū)核苷酸序列；2:ChIL-2基因編碼區(qū)核苷酸推導(dǎo)氨基酸序列；3：NCBI數(shù)據(jù)庫中雞IL-2基因推導(dǎo)氨基酸序列

1：ChIL-18基因編碼區(qū)核苷酸序列；2：ChIL-18基因編碼區(qū)核苷酸推導(dǎo)氨基酸序列；3：NCBI數(shù)據(jù)庫中雞IL-18基因推導(dǎo)氨基酸序列

M：DNA Marker；1：pET32a載體；2：重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2；3：重組原核表達質(zhì)粒pET28a；4：重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18

M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：pET32a載體；2：未純化的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2；3：純化的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2；4：pET28a載體；5：未純化的重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18；6：純化的重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18

M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：pET32a載體；2：未純化的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2；3：純化的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2；4：pET28a載體；5：未純化的重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18；6：純化的重組原核表達質(zhì)粒pET28a-ChIL-18

2.2.2 融合蛋白ChIL-2和ChIL-18的誘導(dǎo)表達情況 SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、菌體培養(yǎng)和純化后的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18菌體蛋白在27 kD(3泳道)和23 kD(6泳道)處可見1條特異性條帶，而空載質(zhì)粒(1和4泳道)經(jīng)誘導(dǎo)后未表達任何蛋白，說明誘導(dǎo)的原核菌體成功表達了融合蛋白ChIL-2和ChIL-18(圖6)。Western blotting檢測結(jié)果也顯示，在27 kD(3泳道)和23 kD(6泳道)處可見特異性條帶，說明原核表達產(chǎn)物即為預(yù)期的ChIL-2和ChIL-18(圖7)。

2.3 ChIL-2和ChIL-18基因的真核表達情況

2.3.1 重組真核表達質(zhì)粒 pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18鑒定結(jié)果 對構(gòu)建的重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18采用KpnI和XbaI進行雙酶切，結(jié)果目的條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖8)，對應(yīng)的測序結(jié)果序列也正確。說明已成功構(gòu)建獲得重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18。

2.3.2 融合蛋白ChIL-2和pVAX1-ChIL-18在Vero細胞內(nèi)的表達情況 將所構(gòu)建的重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-cCHIL-2與pVAX1-cCHIL-18分別轉(zhuǎn)染至Vero細胞中，24 h后取其中3皿(加空白對照)用倒置熒光顯微鏡檢測，結(jié)果(圖9)顯示，與空白對照(圖7-C)比較，圖7-A和圖7-B中均可見熒光，說明融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在Vero細胞中均有表達。

M：DNA Marker；1：pVAX1載體；2：重組真核表達質(zhì)粒pVAX1- ChIL-2；3：重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-18

3 討 論

本研究從雞脾淋巴細胞中擴增的ChIL-2和ChIL-18基因片段全長分別為429和593 bp，其中，ChIL-2基因片段編碼143個氨基酸殘基，ChIL-18基因片段編碼218個氨基酸殘基；氨基酸序列比對分析結(jié)果表明，擴增的ChIL-2基因序列與Sundick公布的雞IL-2基因序列相似性達98.83 %[15]，ChIL-18基因序列與GenBank中公布的雞IL-18基因序列(GenBank：GEU334505.1)相似性為99.83 %，與五彩金剛鸚鵡(Aramacao)(GenBank：GU140075.1)的相似性為99.66 %?？梢?，本研究已成功擴增到ChIL-2和ChIL-18基因序列。

本研究將構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，通過IPTG低溫過夜誘導(dǎo)，融合蛋白ChIL-2和ChIL-18的表達量明顯增高，表明采用pET32a和pET28a表達系統(tǒng)可高效表達ChIL-2和ChIL-18蛋白。Stepaniak等[23]采用pET32a表達系統(tǒng)高效表達了雞IL-2蛋白量，高于采用大腸桿菌Pgex-2系統(tǒng)的表達量，且以可溶性蛋白的形式為主，易回收和純化。Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，鴨白細胞介素2(DuIL-2)和ChIL-2會與其單克隆抗體起免疫交叉反應(yīng)，且DuIL-2能促進雞和鴨兩類脾臟淋巴細胞增殖。原核表達蛋白需要提純，其生物活性也受影響，但已有研究表明，在大腸桿菌中表達的雞IL-2具有刺激T淋巴細胞增殖的生物學(xué)活性；重組的雞IL-2蛋白可在24 h內(nèi)引起外周血CD4+和CD8+細胞比例增加[25]。

本研究還成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18，將二者轉(zhuǎn)染Vero細胞，24 h后熒光檢測發(fā)現(xiàn)融合蛋白ChIL-2和ChIL-18均獲得表達，不僅可為后續(xù)將重組真核表達質(zhì)粒直接用于體內(nèi)獲得表達，還可與疫苗共注射以提高疫苗的免疫原性。由振強等[26]構(gòu)建了雞IL-2真核表達質(zhì)粒pCI-ChIL-2-EGFP，并與H5亞型禽流感油乳劑滅活苗(AIV)共同注射雞體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCI-ChIL-2-EGFP可明顯提高AIV的免疫原性。邵攀峰等[27]將ChIL-18基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/ChIL-18(pIL-18)，并用pIL-18和ILTV弱毒疫苗及其二者聯(lián)合分別免疫21日齡SPF雛雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pIL-18與ILTV弱毒疫苗聯(lián)合免疫組的淋巴細胞亞群CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+明顯高于ILTV弱毒疫苗免疫組，ILTV強毒攻毒后發(fā)病雞數(shù)量少，且發(fā)病癥狀較輕。

A：融合蛋白ChIL-2；B：融合蛋白ChIL-18；3：空白對照

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建的ChIL-2和ChIL-18基因重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ChIL-2和pET32a-ChIL-18及重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18，分別在大腸桿菌和Vero細胞中獲得高表達，即克隆獲得的IL-2和IL-18基因可在原核和真核細胞中高效表達，為后續(xù)研究IL-2和IL-18蛋白的融合表達、生物學(xué)活性及疫苗的免疫作用打下了基礎(chǔ)。