姜飛虹，雷歡慶，任婷婷，孟掉琴，岳田利,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（楊凌），陜西 楊凌 712100;3.國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

中國(guó)是蘋果生產(chǎn)大國(guó)，2017年我國(guó)蘋果種植面積250.96萬(wàn) hm2，產(chǎn)量4 548.40萬(wàn) t，均居世界首位[1]。蘋果汁是有機(jī)酸的天然來源之一，有機(jī)酸含量豐富[2-4]，特別是L-蘋果酸含量最高[5]，有機(jī)酸具有改善記憶[6]、抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)藥物吸收[7]等眾多功能。因此可以利用豐富的蘋果資源來提取天然有機(jī)酸。傳統(tǒng)的有機(jī)酸提取方法一般為鈣鹽沉淀法[8]與有機(jī)溶劑萃取法[9-10]，這兩種方法均引入外加試劑，后續(xù)處理復(fù)雜，有機(jī)酸回收成本高。近年來有學(xué)者利用離子交換樹脂[11-13]、殼聚糖[14-16]等材料來吸附分離溶液中的有機(jī)酸，取得一定的進(jìn)展。目前關(guān)于蘋果汁有機(jī)酸吸附分離的報(bào)道較少，僅有學(xué)者利用樹脂型吸附劑來吸附分離蘋果汁中的有機(jī)酸[11-12]。但樹脂型吸附劑對(duì)有機(jī)酸的吸附量以及吸附選擇性不高、吸附劑回收以及重生困難、操作繁瑣。殼聚糖是一種天然可降解的堿性多糖，價(jià)廉易得、無毒無害、生物相容性好，在水處理[17-18]、固定化酶[19]、多酚吸附[20]、重金屬吸附[21]、藥物載體[22-23]等方面都有廣泛的應(yīng)用。殼聚糖富含氨基，可以用來吸附有機(jī)酸[14]。但是殼聚糖在酸性溶液中易流失，且與溶液分離困難，難以直接利用。因此考慮將殼聚糖與磁性材料相結(jié)合，通過反相懸浮交聯(lián)法制成磁性殼聚糖復(fù)合微球，使之既可以利用殼聚糖層的氨基基團(tuán)發(fā)揮吸附作用，又能兼具良好的磁響應(yīng)性能，磁性殼聚糖復(fù)合微球具有操作簡(jiǎn)便、分離快速、分離效率高等眾多優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)一般傳統(tǒng)分離方法的不足。本實(shí)驗(yàn)旨在制備一種磁響應(yīng)強(qiáng)的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球，用于吸附分離蘋果汁中的有機(jī)酸，并且微球洗脫之后可以反復(fù)使用，為建立一種新型環(huán)保的有機(jī)酸吸附分離方法提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

70 °Brix濃縮蘋果汁購(gòu)自陜西省海升果業(yè)有限公司。殼聚糖（脫乙酰度90%以上）購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合硫酸亞鐵（FeSO4·4H2O）、冰乙酸（體積分?jǐn)?shù)99.7%）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～28%的氨水、體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛溶液、體積分?jǐn)?shù)33%的濃鹽酸、氫氧化鈉、六偏磷酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純;液體石蠟、失水山梨醇脂肪酸酯（Span80）、石油醚（沸程60～90 ℃）、丙酮等均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

GS2B-B電子恒溫?cái)嚢杵?上海安亭電子儀器廠;HH-6恒溫水浴器 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KO-600DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;JEM1230透射電子顯微鏡 日本JEOL公司;JSM-6360LV掃描電子顯微鏡 日本電子公司;D8 ADVANCE X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國(guó)Bruker公司;TA-60WS+DTG-60A差熱熱重同步分析儀 日本島津公司;MPMS-XL-7超導(dǎo)量子干涉磁測(cè)量系統(tǒng) 美國(guó)Quantum Design公司;iMark Microplate Reader 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4納米顆粒的制備

利用化學(xué)共沉淀法[24-25]制備Fe3O4納米顆粒，其反應(yīng)方程式如式（1）所示。

將0.05 mol/L FeSO4與0.1 mol/L FeCl3的混合溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌，用氨水調(diào)節(jié)pH值至10[26]。80 ℃水浴熟化30 min，冷卻至室溫后，用磁鐵收集，并用蒸餾水洗滌至中性備用。

1.3.2 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的制備

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的殼聚糖醋酸溶液置于燒杯中，將制備好的Fe3O4納米顆粒與殼聚糖按質(zhì)量比3∶4混合均勻后，緩緩加入到均勻的油相（40 mL Span 80、300 mL液體石蠟、300 mL石油醚）中。于室溫下1 200 r/min攪拌30 min，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)6.25%戊二醛，反應(yīng)1 h，再次加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)6.25%戊二醛繼續(xù)反應(yīng)2 h。產(chǎn)物依次用石油醚、丙酮、0.1 mol/L NaOH溶液、去離子水洗滌至中性，真空冷凍干燥備用[27]。

1.3.3 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的表征

將制備好的Fe3O4磁流體稀釋后，滴加到銅網(wǎng)上，室溫自然晾干，然后用透射電子顯微鏡觀察顆粒的形態(tài)與粒徑。將干燥后的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球用導(dǎo)電膠固定后濺金，噴金條件為：40 mA、80 s，利用掃描電子顯微鏡對(duì)微球的形貌進(jìn)行表征;將干燥后的微球用蒸餾水溶解，加入數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的六偏磷酸鈉助分散劑，在350 W條件下超聲10 min，利用激光粒度儀在淀粉模式下對(duì)磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的粒徑與分布進(jìn)行測(cè)定;利用具有Cu Kα放射源（λ=0.154 nm）的XRD測(cè)定Fe3O4納米顆粒、磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的晶體結(jié)構(gòu);在室溫環(huán)境下，采用KBr壓片處理，對(duì)Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球進(jìn)行FTIR測(cè)定，分辨率4 cm-1、掃描次數(shù)32 次、掃描范圍400～4 000 cm-1;利用熱重分析儀對(duì)磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球中Fe3O4的含量進(jìn)行測(cè)定，分別取Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球3 種樣品，在氣流流速50 mL/min的氮?dú)猸h(huán)境下，將樣品從25 ℃以10 ℃/min的升溫速率加熱至800 ℃;利用超導(dǎo)量子干涉磁測(cè)量系統(tǒng)對(duì)殼聚糖包埋前后的Fe3O4納米顆粒進(jìn)行磁滯回線的測(cè)定分析，測(cè)量環(huán)境條件為室溫，磁場(chǎng)強(qiáng)度的變化范圍為±20 000 Oe。

1.3.4 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的可回收性評(píng)價(jià)

磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的可回收程度決定了所制備的微球今后的應(yīng)用領(lǐng)域及應(yīng)用前景。在室溫條件下，將Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球置于1 T磁場(chǎng)下，對(duì)其在不同時(shí)間及不同pH值條件下的可回收程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。用去離子水（pH 7）配制不同質(zhì)量濃度的Fe3O4納米顆粒及磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球，研究在同一磁場(chǎng)不同作用時(shí)間下兩種顆粒的回收率，其中磁場(chǎng)作用時(shí)間范圍為10 s～5 min。同時(shí)，為了更好地了解不同pH值環(huán)境對(duì)Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球可回收程度的影響，將兩種顆粒加入到不同pH值的溶液中，磁場(chǎng)作用10 s分別測(cè)定其回收率。回收率計(jì)算公式見式（2）。

式中：ρ0為磁性材料的初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρt為t時(shí)刻磁性材料質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

Fe3O4質(zhì)量濃度的測(cè)定采用分光光度法[28-29]，取樣100 mL于96 孔板中，加入30 mL濃鹽酸溶液，60 ℃保溫箱中充分消化2 h至顏色澄清透亮。再加入10 mL 1.5 mg/mL的過硫酸鉀溶液使溶液中的Fe2+被氧化為Fe3+。最后加入60 mL 0.1 mol/L的硫氰酸鉀溶液至上述溶液中，與Fe3+生成血紅色的硫氰酸鐵離子[Fe(SCN)n]3-n（n＝1～6）絡(luò)合物，靜置反應(yīng)10 min。利用iMark Microplate Reader在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。通過已知濃度的FeCl3·6H2O溶液建立鐵離子在相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁有機(jī)酸的重復(fù)利用評(píng)價(jià)

精確稱取0.500 0 g磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球，加入30 mL一定濃度（有機(jī)酸質(zhì)量濃度為2.32 mg/mL）的蘋果汁，25 ℃、150 r/min條件下振蕩吸附不同時(shí)間，磁分離后，對(duì)不同吸附時(shí)間樣品的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算吸附量。吸附后的微球用蒸餾水洗滌4 次后，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氨水中振蕩不同時(shí)間，磁分離，對(duì)洗脫液進(jìn)行真空旋蒸，計(jì)算不同解吸時(shí)間下的解吸量。此過程重復(fù)3 次，考察磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁有機(jī)酸的重復(fù)利用情況。吸附量、解吸量以及有機(jī)酸回收率分別按公式（3）～（5）計(jì)算。

式中：V為樣品體積/mL;ρ0為蘋果汁的初始有機(jī)酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）;ρt為t時(shí)刻蘋果汁中的有機(jī)酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）;m為磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的加入質(zhì)量/g。

式中：V為解吸液體積/mL;ρt為t時(shí)刻解吸液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）;m為磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的加入質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），鄧肯氏多重域檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平設(shè)為P＜0.05，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取其平均值。采用Origin 9.0軟件進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 形貌與粒徑分布

圖 1 磁性Fe3O4的透射電子顯微鏡照片（a）及粒徑統(tǒng)計(jì)分布（b）Fig. 1 Transmission electron micrograph (a) and particle size distribution (b) of pure Fe3O4 nanoparticles

圖 2 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的掃描電子顯微鏡照片（a）和激光粒度儀粒徑分布（b）Fig. 2 Scanning electron microscopic image (a) and malvern size distribution diagram (b) of magnetic Fe3O4/chitosan microspheres

殼聚糖分子鏈上含有大量的自由氨基，這些氨基可以通過戊二醛交聯(lián)劑的兩個(gè)醛基互相交聯(lián)，最終包裹Fe3O4納米顆粒形成磁性殼聚糖微球。在殼聚糖層交聯(lián)和硬化的過程中，自由水被擠壓出微球，同時(shí)殼聚糖層的交聯(lián)度也隨之增加。圖1是磁性Fe3O4納米顆粒的透射電子顯微鏡照片和粒徑頻率統(tǒng)計(jì)分布圖。從圖1b中可以看出，磁性Fe3O4納米顆粒的粒徑分布范圍為8～19 nm，小于室溫條件下磁性Fe3O4納米粒子具有超順磁性的臨界尺寸;同時(shí)由圖1a的透射電子顯微鏡照片可以看出磁性Fe3O4納米顆粒的分散性較差，存在明顯的物理聚集現(xiàn)象。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，一方面與磁性Fe3O4納米顆粒之間磁力的相互作用有關(guān);另一方面，顆粒本身非常小的納米粒徑以及較高的比表面能也會(huì)引起Fe3O4納米顆粒產(chǎn)生非常明顯的物理聚集[30]。由圖2a掃描電子顯微鏡照片可以看出，制備的復(fù)合微球?yàn)槲⒚准?jí)，呈現(xiàn)規(guī)則球形，分散性較好，表面光滑或有核桃狀褶皺。因?yàn)榇判訤e3O4/殼聚糖微球采用真空冷凍干燥，大部分顆粒在干燥后能保持較完整的原始表面形態(tài)，但仍有小部分微球因?yàn)槔鋬霾坏轿?，?dǎo)致在干燥過程中迅速失水而皺縮，產(chǎn)生核桃狀褶皺。由圖2b可知，復(fù)合微球激光粒度儀粒徑主要分布在22～158 μm，d（0.1）為36.765 μm，即有10%的微球粒徑小于36.765 μm;d（0.5）為72.987 μm，為微球的中值粒徑，即50%的微球粒徑小于或者大于72.987 μm;d（0.9）為124.786 μm，即90%的微球粒徑小于124.786 μm。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)制備的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?yàn)槲⒚准?jí)，分散狀態(tài)良好，基本服從正態(tài)分布，且分布帶較窄，可以最大程度保證不同批次反應(yīng)的同質(zhì)性。

2.2 XRD衍射分析結(jié)果

為了確認(rèn)所制備的Fe3O4納米顆粒以及磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球中包含的Fe3O4納米顆粒是否為純Fe3O4，對(duì)兩種樣品分別進(jìn)行了XRD分析。由圖3可知，F(xiàn)e3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的XRD圖譜在衍射角30.373°、35.742°、43.325°、53.983°、57.338°、62.911°等處分別出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)Fe3O4220、311、400、422、511、440等晶面方向的衍射，與國(guó)際衍射數(shù)據(jù)中心提供的Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡（PDF No. 65-3107）中的XRD圖譜的特征峰吻合，由此可確認(rèn)磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球中包埋的Fe3O4納米顆粒是具有反相尖晶石型結(jié)構(gòu)的純Fe3O4

[31]。而Fe3O4納米顆粒與磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的XRD圖譜分析結(jié)果具有一致性，表明在磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的制備過程中，殼聚糖對(duì)Fe3O4納米顆粒的包埋過程不會(huì)造成Fe3O4晶體結(jié)構(gòu)的改變。

圖 3 Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球XRD圖譜Fig. 3 XRD patterns of naked Fe3O4 nanoparticles and magnetic Fe3O4/chitosan composite microspheres

根據(jù)Fe3O4納米顆粒的XRD圖譜，利用Debye-Scherrer公式[31]（式（6）），可推算Fe3O4納米顆粒的粒徑。

式中：D為Fe3O4納米顆粒垂直于各晶面方向上晶粒的厚度/nm;K為Debye-Scherrer常數(shù);λ為入射波長(zhǎng)/nm;β為半峰寬/rad;θ為布拉格角/（°）。

根據(jù)公式可以計(jì)算出各個(gè)晶面衍射方向?qū)?yīng)的厚度分別為9.1 nm（220）、8.1 nm（311）、8.8 nm（400）、8.3 nm（422）、11.6 nm（511）、9.1 nm（440），求得Fe3O4納米顆粒的平均粒徑為9.1 nm，其粒徑小于室溫條件下超順磁的臨界粒徑，因此可以證明Fe3O4納米顆粒具有超順磁性。

2.3 FTIR分析結(jié)果

圖 4 Fe3O4納米顆粒、殼聚糖和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的FTIR分析圖譜Fig. 4 FTIR spectra of Fe3O4, chitosan and magnetic Fe3O4/chitosan composite microspheres

為了確認(rèn)殼聚糖已經(jīng)包埋在Fe3O4納米顆粒的表面，形成了磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球，對(duì)Fe3O4納米顆粒、殼聚糖和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球進(jìn)行了FTIR分析，結(jié)果如圖4所示。Fe3O4納米顆粒FTIR圖譜顯示586 cm-1處存在一個(gè)強(qiáng)烈的伸展吸收峰，這個(gè)特征吸收峰是Fe3O4納米顆粒所特有的Fe-O-Fe基團(tuán)。殼聚糖FTIR圖譜顯示在1 651 cm-1和1 599 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，分別對(duì)應(yīng)酰胺I帶峰C=O的伸縮振動(dòng)和酰胺II帶峰N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)[32];此外，1 381 cm-1附近是CH3的C—H的變形振動(dòng)吸收峰，這是殼聚糖沒有完全脫乙酰所致。1 076 cm-1處對(duì)應(yīng)的是殼聚糖主鏈仲羥基C—O的伸縮振動(dòng)吸收峰[33]。由磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的FTIR光譜結(jié)果可知，F(xiàn)e-O-Fe基團(tuán)的特征吸收峰偏移到了582 cm-1處，在1 638 cm-1處對(duì)應(yīng)的是戊二醛與殼聚糖發(fā)生反應(yīng)形成Schiff堿的特征吸收峰[32,34]，結(jié)果表明Fe3O4納米顆粒成功地被交聯(lián)殼聚糖層包埋形成了磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球。

2.4 熱重分析結(jié)果

為了能夠確定Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球中Fe3O4、殼聚糖的質(zhì)量，利用熱重分析儀對(duì)Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球進(jìn)行熱重分析，結(jié)果如圖5所示。整個(gè)升溫過程中Fe3O4納米顆粒質(zhì)量損失不明顯，由物理水分蒸發(fā)造成的損失率僅為2.12%[35]。由圖5曲線b、c可以看出，在溫度升高至100 ℃時(shí)，殼聚糖粉末和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球分別有5.34%和4.03%的質(zhì)量損失，這些損失是樣品中物理水分的移除所造成的。磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球比殼聚糖裂解時(shí)間早，分別在200 ℃和260 ℃進(jìn)入快速裂解過程，這可能是因?yàn)槲⑶驓ぞ厶菍咏?jīng)過戊二醛交聯(lián)形成的Schiff堿比殼聚糖粉末的主鏈更容易發(fā)生斷裂，使得復(fù)合微球熱穩(wěn)定性下降，這種現(xiàn)象與張海真[36]的研究結(jié)果一致。

此外，殼聚糖粉末在溫度從260 ℃升高至400 ℃的過程中，熱分解持續(xù)快速進(jìn)行，質(zhì)量損失45.52%。400 ℃以后，降解速率逐漸放緩，此時(shí)樣品的質(zhì)量損失可能是殘留殼聚糖或殼聚糖降解中間化合物的緩慢降解引起的。而磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的降解過程從200 ℃一直持續(xù)到700 ℃，此過程質(zhì)量損失率達(dá)到51.45%。通過計(jì)算樣品800 ℃時(shí)的質(zhì)量損失率，可以得知Fe3O4約占磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球總質(zhì)量的38.66%，這與化學(xué)計(jì)算方法[36]得出的結(jié)果基本一致。

圖 5 Fe3O4納米顆粒、殼聚糖和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的熱重分析曲線Fig. 5 Thermogravimetric curves of naked Fe3O4, chitosan and Fe3O4/chitosan composite microspheres

2.5 磁滯回線分析結(jié)果

圖 6 Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的磁滯回線Fig. 6 Hysteresis loops of naked Fe3O4 and magnetic Fe3O4/chitosan composite microspheres

圖6為Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的磁滯回線，F(xiàn)e3O4納米顆粒與磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的磁滯回線基本通過原點(diǎn)，沒有磁滯現(xiàn)象，沒有發(fā)現(xiàn)剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力，表明制備的Fe3O4納米顆粒在室溫下是超順磁的，被殼聚糖包埋后也沒有改變其超順磁性質(zhì)[19,32,37]。Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的飽和磁化強(qiáng)度分別為78.16 emu/g和35.98 emu/g。復(fù)合微球較Fe3O4納米顆粒的飽和磁化強(qiáng)度有所下降，這是兩種樣品相同質(zhì)量下Fe3O4磁性物質(zhì)的含量不同[32]造成的。根據(jù)熱重分析的結(jié)果，F(xiàn)e3O4約占磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球總質(zhì)量的38.66%，換算成相同質(zhì)量的Fe3O4時(shí)，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的飽和磁化強(qiáng)度約為93.07 emu/g，反而高于相同質(zhì)量的Fe3O4納米顆粒。這是因?yàn)镕e3O4納米顆粒在空氣中會(huì)部分氧化成Fe2O3，導(dǎo)致磁性下降;而經(jīng)過殼聚糖的包埋后，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球中的Fe3O4納米顆粒不容易被氧化，反而會(huì)具有比較高的飽和磁化強(qiáng)度。

2.6 回收率分析結(jié)果

磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的磁分離在實(shí)際應(yīng)用中是非常重要的環(huán)節(jié)，直接決定了所制備材料的可回收性能。實(shí)驗(yàn)中對(duì)Fe3O4納米顆粒以及磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球在實(shí)際外加磁場(chǎng)（1 T）下不同回收時(shí)間和不同pH值的回收率進(jìn)行了測(cè)定。圖7是中性條件（pH 7.0）下，回收時(shí)間對(duì)Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球回收率的影響?？梢钥吹较嗤|(zhì)量濃度、相同時(shí)間下，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球比Fe3O4納米顆粒更容易回收，這是因?yàn)槿绻麚Q算成相同質(zhì)量的Fe3O4，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的飽和磁化強(qiáng)度要高于Fe3O4納米顆粒;同時(shí)微球中包埋的磁性納米顆粒很多，表現(xiàn)出的磁響應(yīng)特性是所有Fe3O4納米顆粒的總和，所以磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球表現(xiàn)出的磁響應(yīng)性更強(qiáng)，回收率更高。質(zhì)量濃度為5 mg/mL的Fe3O4納米顆粒在5 min時(shí)可以達(dá)到99.99%的回收率，而3 mg/mL與1 mg/mL的Fe3O4納米顆粒在5 min時(shí)分別可以達(dá)到99.98%和99.96%的回收率。磁性Fe3O4納米顆粒高質(zhì)量濃度比低質(zhì)量濃度回收率高，是因?yàn)榇判訤e3O4納米顆粒在溶液中極易團(tuán)聚，質(zhì)量濃度越高，團(tuán)聚越明顯，經(jīng)過團(tuán)聚的磁性Fe3O4顆粒，其磁化強(qiáng)度要高于單一的Fe3O4納米顆粒;因此在磁場(chǎng)作用下，回收速率更快，回收率更高。不同質(zhì)量濃度的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球磁場(chǎng)作用10 s的回收率均可達(dá)到99.9%以上，隨著回收時(shí)間的延長(zhǎng)，其回收率也隨之增加，2 min以后回收率基本可達(dá)到100%（比色法無法檢測(cè)到殘留），且隨著回收時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率不再發(fā)生明顯變化。

圖 7 回收時(shí)間對(duì)Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球回收率的影響Fig. 7 Effect of recovery time on recovery rate of naked Fe3O4 and magnetic Fe3O4/chitosan microspheres

圖8是不同pH值對(duì)Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球回收率的影響（質(zhì)量濃度均為5 mg/mL，回收時(shí)間10 s），可以看到，在不同pH值下，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的回收率均高于Fe3O4納米顆粒，且受pH值影響不明顯。當(dāng)pH值低于8時(shí)，F(xiàn)e3O4納米顆粒的回收率隨著pH值的增加而顯著增大（P＜0.05）;pH值高于8時(shí)，隨著pH值的增加，回收率又顯著減?。≒＜0.05）。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能與Fe3O4納米顆粒在不同pH值下攜帶的表面電荷量不同有關(guān)[38]。在中性條件下，F(xiàn)e3O4納米顆粒的表面電位接近于零，而在酸性或者堿性環(huán)境下會(huì)分別帶正電荷與負(fù)電荷，這些電荷間的相互作用可能會(huì)抵消一部分磁場(chǎng)作用，使得酸性或者堿性環(huán)境下Fe3O4納米顆粒的回收率相較中性環(huán)境低。磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球在pH 3～11范圍內(nèi)回收率沒有顯著性差異（P＞0.05），10 s時(shí)的回收率均達(dá)到99.9%以上;pH值為2時(shí)顯著低于其他pH值下的回收率（P＜0.05）。這可能是由于極端pH值下，殼聚糖上的氨基基團(tuán)在酸性溶液中易于陽(yáng)離子化而存在Fe3O4納米顆粒的增溶現(xiàn)象[37]。可回收程度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的回收率因回收時(shí)間不同而存在差異，同時(shí)由于表面殼聚糖層的存在，大幅減小了pH值對(duì)微球回收率的影響，擴(kuò)大了磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的應(yīng)用范圍。良好的磁響應(yīng)特性和足夠高的可回收程度保證了實(shí)驗(yàn)中制備的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球在水環(huán)境（或蘋果汁）分離系統(tǒng)中具有切實(shí)可行的應(yīng)用前景。

圖 8 pH值對(duì)Fe3O4納米顆粒和磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球回收率的影響Fig. 8 Effect of pH on recovery rate of naked Fe3O4 and Fe3O4/chitosancomposite microspheres

2.7 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁中有機(jī)酸的可重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖 9 磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?qū)μO果汁有機(jī)酸的吸附與解吸評(píng)價(jià)Fig. 9 Adsorption and desorption of organic acids from apple juice using magnetic Fe3O4/chitosan microspheres

圖9為磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁中有機(jī)酸的可重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果。蘋果汁初始有機(jī)酸質(zhì)量濃度為2.32 mg/mL，微球加入量0.5 g，吸附與解吸溫度均在25 ℃下進(jìn)行。有機(jī)酸的解吸過程是在4%氨水溶液中完成的。

磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁有機(jī)酸的具體反應(yīng)原理為微球表面殼聚糖層所攜帶的氨基與有機(jī)酸電離出的氫離子形成質(zhì)子化胺，質(zhì)子化胺帶正電，有機(jī)酸電離的羧酸根帶負(fù)電，由于正負(fù)電的互相吸引而產(chǎn)生吸附作用[14]。加入堿性溶液后，微球表面的氨基基團(tuán)將產(chǎn)生去質(zhì)子化，引起微球表面殼聚糖層與有機(jī)酸分子之間的靜電作用變?nèi)?，從而使有機(jī)酸分子從微球上解吸下來[39]，這樣達(dá)到飽和吸附的磁性殼聚糖復(fù)合微球就可以再生而反復(fù)利用?；诖朔磻?yīng)原理，使得磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球具有一定的吸附選擇性，在復(fù)雜的蘋果汁基質(zhì)中，只會(huì)選擇吸附能夠解離出氫離子與羧酸根離子的有機(jī)酸，而對(duì)蘋果汁中存在的葡萄糖、果糖等其他物質(zhì)很難產(chǎn)生吸附作用。式（7）、（8）為磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球表面殼聚糖層吸附與解吸蘋果汁中有機(jī)酸的原理方程式。

式中：HA代表吸附質(zhì);MCMs-NH2代表吸附劑。

從圖9可以看出，整個(gè)過程包括3 個(gè)周期。每個(gè)周期分別包括一個(gè)90 min的吸附過程和一個(gè)20 min的解吸過程。對(duì)第一個(gè)周期，在吸附的初始階段，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?qū)μO果汁中有機(jī)酸的吸附量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在70 min時(shí)吸附基本達(dá)到平衡狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量不再發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），最終平衡吸附量達(dá)到了111.54 mg/g;吸附結(jié)束后，進(jìn)入解吸過程，用4%的氨水溶液對(duì)吸附完畢的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球進(jìn)行解吸，測(cè)得解吸時(shí)間不同，有機(jī)酸回收量也不同。前15 min內(nèi)，有機(jī)酸回收量隨著解吸時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增大（P＜0.05），15～20 min有機(jī)酸回收量略有下降，但并沒有產(chǎn)生顯著性差異（P＞0.05）。由此可知解吸時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，解吸15 min，回收得到的有機(jī)酸含量為97.00 mg/g，有機(jī)酸回收率為86.97%。解吸液中的有機(jī)酸并不能被完全回收，一方面是因?yàn)樾D(zhuǎn)蒸發(fā)過程中會(huì)造成部分揮發(fā)性酸的損失;另一方面是實(shí)驗(yàn)條件下氨氣并不能100%從解吸液中完全蒸出，會(huì)有微量殘留，中和一部分有機(jī)酸，使有機(jī)酸回收結(jié)果偏低。利用再生后的磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?qū)μO果汁中有機(jī)酸進(jìn)行第二次吸附與解吸過程，吸附量與回收率會(huì)有微弱下降，但并沒有產(chǎn)生顯著性差異（P＞0.05）。第3次吸附與解吸過程中有機(jī)酸吸附量與回收率分別為109.92 mg/g、86.86%，有機(jī)酸吸附量較第一次吸附顯著下降（P＜0.05），但回收率卻沒有產(chǎn)生顯著性變化（P＞0.05）。第3次吸附量明顯減少是因?yàn)槊看谓馕⒉荒茏龅?00%釋放出所有的吸附位點(diǎn)，所有的吸附與解吸過程都存在動(dòng)態(tài)平衡;解吸不徹底，導(dǎo)致仍有少量吸附位點(diǎn)被占用，重復(fù)利用次數(shù)越多，累積占用的位點(diǎn)就越多，會(huì)導(dǎo)致有機(jī)酸吸附量慢慢降低，但這種變化是緩慢的，第3次吸附過程也只是降低到首次吸附量的98.55%。因此對(duì)磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球吸附蘋果汁有機(jī)酸的可重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果可知，所制備的磁性微球可以完全滿足進(jìn)一步的再生和重復(fù)利用要求。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)酸提取分離方法，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球在吸附蘋果汁有機(jī)酸時(shí)，不必額外引入外加試劑，在磁場(chǎng)作用下可以快速實(shí)現(xiàn)固液分離，不會(huì)對(duì)被分離物造成破壞。并且解吸之后可以循環(huán)多次利用，最大程度地簡(jiǎn)化操作工藝，節(jié)約生產(chǎn)成本。

3 討 論

蘋果汁中含有蘋果酸、草酸、檸檬酸、乳酸等多種有機(jī)酸[4]，每一種有機(jī)酸均可以電離生成H+，與磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球上的氨基結(jié)合形成質(zhì)子化胺，質(zhì)子化胺帶正電，羧酸根帶負(fù)電，由于正負(fù)電荷的互相吸引而產(chǎn)生吸附作用，因此磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球不能選擇性吸附某一種單一成分的有機(jī)酸，只能吸附總有機(jī)酸。解吸后得到的有機(jī)酸是所有組分的混合物，如果想要得到單一組分的有機(jī)酸還需要經(jīng)過分離純化等后續(xù)處理，操作過程復(fù)雜繁瑣。因此后續(xù)研究可以考慮在磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球的基礎(chǔ)上，采用分子印跡技術(shù)直接對(duì)單一組分的有機(jī)酸進(jìn)行吸附分離。有研究者合成了基于磁性殼聚糖微球的分子印跡聚合物，能夠選擇性識(shí)別與快速分離氯霉素靶分子[40]，杜春燕等[41]利用磁性分子印跡材料來分離富集水中的雙酚A。因此，可以將磁性殼聚糖微球作為支撐載體結(jié)合表面分子印跡技術(shù)來分離蘋果汁中的L-蘋果酸、檸檬酸等單一有機(jī)酸，同時(shí)也可以將其應(yīng)用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大到其他單一天然產(chǎn)物的分離提取中。

4 結(jié) 論

利用反相懸浮交聯(lián)法制備磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球，所得微球呈規(guī)則球形，粒徑為22～158 μm，飽和磁化強(qiáng)度35.98 emu/g，具有超順磁性，F(xiàn)e3O4質(zhì)量約占微球質(zhì)量的38.66%，殼聚糖包埋過程并未改變其晶體結(jié)構(gòu)。磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球在特定磁場(chǎng)下的回收率受pH值的影響較Fe3O4納米顆粒小，磁場(chǎng)作用10 s就可以達(dá)到99.90%以上的回收率，且隨著回收時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率會(huì)繼續(xù)增大，2 min后回收率基本趨向于100%。磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?qū)μO果汁有機(jī)酸的吸附量隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，70 min達(dá)到吸附平衡，平衡吸附量為111.54 mg/g;15 min解吸完全，有機(jī)酸回收率86.97%。反復(fù)使用3 次后，磁性Fe3O4/殼聚糖復(fù)合微球?qū)τ袡C(jī)酸的回收率并未顯著下降。