生吉萍，趙瑞瑞，陳玲玲，申 琳,*

（1.中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

果蔬是重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是重要的食物來源，其在生長發(fā)育、采后貯藏保鮮過程中容易受到病原微生物侵染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，病原菌每年大約造成全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失15%[1]，同時(shí)也會產(chǎn)生食品安全問題?；移咸焰呔˙otrytis cinerea）是最常見的真菌病原菌之一，寄主范圍非常廣泛，能夠感染200余種作物，對作物的花、葉、果實(shí)等部位造成侵染性病害，嚴(yán)重危害著果蔬的生長發(fā)育過程和采后貯藏保鮮。

番茄是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在生長發(fā)育和采后貯藏中容易受到灰葡萄孢菌侵染，目前，防治番茄病害最普遍有效的方法是化學(xué)殺菌，但化學(xué)殺菌劑的頻繁使用不僅使果蔬產(chǎn)生耐藥菌，也使得農(nóng)藥殘留量逐漸增加，嚴(yán)重危害人類健康和生態(tài)環(huán)境[2]。隨著人民生活品質(zhì)的提高，食品安全和環(huán)境污染問題日益受到關(guān)注，開發(fā)更加安全、環(huán)保的病害防控方法成為當(dāng)務(wù)之急。

褪黑素的化學(xué)名稱是N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，因其在動物中是由大腦的“松果體腺”分泌的一種激素，又被叫作松果體素。褪黑素廣泛存在于生物體中，是動植物、微生物進(jìn)化過程中一種保守的分子。1995年，人們首次在植物中檢測到褪黑素[3]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素普遍存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中，其含量很低，通常每克組織樣品含褪黑素的質(zhì)量數(shù)量級為pg～ng[4-6]。研究表明，褪黑素不僅在植物根、莖等器官的發(fā)育過程中發(fā)揮作用，還在植物頂端優(yōu)勢、開花、衰老等過程中發(fā)揮重要作用。在生物和非生物脅迫方面，褪黑素在植物清除活性氧自由基，抗鹽、高溫、干旱、紫外線、重金屬和化學(xué)藥劑等逆境脅迫中起著重要的作用，除此以外，褪黑素還能提高蘋果樹抗褐斑病、擬南芥抗PstDC3000病原菌侵染的能力;但褪黑素在采前果實(shí)中應(yīng)用與機(jī)理研究還鮮見報(bào)道。

本研究以褪黑素采前噴施番茄植株，研究其對采后果實(shí)抗灰葡萄孢菌能力和品質(zhì)的影響，為實(shí)際種植中選擇適宜濃度褪黑素緩解番茄病害、提高果實(shí)的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)于2017年7月在北京市通州番茄種植園區(qū)進(jìn)行，供試材料為番茄植株（Solanum lycopersicumcv. Ailsa Craig），生長正常，管理水平良好。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC編號36028，使用之前于PDA平皿中培養(yǎng)10 d，長有灰色孢子時(shí)使用。

褪黑素、幾丁質(zhì)、蝸牛酶、昆布多糖、L-苯丙氨酸美國Sigma公司;抗壞血酸、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、Tween-80等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-YL270型-20 ℃低溫冰箱、DW-HL340型-80 ℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司;高速臺式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;PB-10 pH計(jì)北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;UV-1800紫外-可見光分光光度計(jì) 島津醫(yī)療器械（北京）有限公司;KHW-D-1恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;LX-B高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;CFX96實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將植株按照開花時(shí)間標(biāo)記花期，于開花后15 d噴施處理，噴施時(shí)將大棚內(nèi)隨機(jī)劃分為5 個(gè)區(qū)域，并將各組處理進(jìn)行隔離。將褪黑素溶解于蒸餾水中，配制成1、50、100 μmol/L和150 μmol/L的溶液，對照組為蒸餾水處理組，不同濃度褪黑素和蒸餾水分別噴灑于全株番茄植株，每株噴施100 mL。每隔7 d噴一次，共噴4 次，待果實(shí)成長為綠熟期果實(shí)（開花之后45 d左右）后采收大小均勻、形狀和成熟度相對一致、無蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。先放置12 h散去田間熱，再將果實(shí)在體積分?jǐn)?shù)3%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min消毒，清水洗凈，晾干。每組選擇10 個(gè)番茄果實(shí)，進(jìn)行損傷接種。

損傷接種參照Yu Wenqing等[7]的方法，稍作修改。在無菌條件下，用含體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80的無菌水將PDA平板上的灰霉病原菌孢子洗脫下來，漩渦振蕩，紗布過濾，用無菌水將孢子懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至2×105～2×106CFU/mL備用。接種前，在超凈臺中用無菌的200 μL槍頭在果實(shí)赤道部4 個(gè)方向分別扎直徑2 mm、深度4 mm的小孔，然后注入10 μL的孢子懸浮液。接種后的番茄果實(shí)（25±1）℃、90%～95%相對濕度條件下貯藏，每天統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑，得到最適濃度，然后測定最適濃度處理組和對照組的其他指標(biāo)，其中抗病相關(guān)酶活力和基因相對表達(dá)量測定時(shí)分別在0、2、4、8、16、24、72、120、168 h取樣，營養(yǎng)指標(biāo)測定在0、1、3、5、7 d取樣。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.3.2 發(fā)病率及病斑面積測定

發(fā)病率和病斑面積分別按公式（1）、（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：d表示病斑直徑/cm。

1.3.3 抗病酶活力測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力的測定參照曹建康等[8]的方法。以每小時(shí)每克樣品吸光度分別在290、420 nm波長處變化1為一個(gè)PAL、PPO活力單位（U），單位為U/g。以每秒鐘每克樣品中分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol Glc-NAc為一個(gè)CHI活力單位，以每秒鐘每克樣品中酶分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖為一個(gè)GLU活力單位。以上酶活力單位均為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 抗壞血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量測定

抗壞血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍缀康膯挝粸閙g/g，可滴定酸含量單位為g/100 g，VC含量單位為μg/g，結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 抗病基因相對表達(dá)量測定

番茄果實(shí)總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qPCR采用試劑盒方法進(jìn)行。

番茄抗病相關(guān)基因PR1、NPR1、PI II和LoxD表達(dá)量分析參照Zhang Shujuan等[9]的方法進(jìn)行，并加以修改。以SlACTIN7為內(nèi)參基因，按照qPCR引物設(shè)計(jì)原則，參考表1設(shè)計(jì)特異性引物。

表 1 實(shí)時(shí)定量PCR的特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for quantitative polymerase chain reaction analysis

qPCR擴(kuò)增體系為：1 μL cDNA樣品、5 μL 2×Mix、0.3 μL上下游引物，雙蒸水補(bǔ)至10 μL。CFX 96 qPCR儀中運(yùn)行程序，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán);95～60 ℃（16 s）條件下分析溶度曲線。每個(gè)cDNA樣品平行檢測3 次?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量的計(jì)算應(yīng)用2-△△Ct方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2011軟件統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并作圖。應(yīng)用SPSS 18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)抗病性的影響

圖 1 采前褪黑素處理對番茄果實(shí)接種灰葡萄孢菌后發(fā)病情況的影響Fig. 1 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the incidence of tomato fruit inoculated with Botrytis cinerea

如圖1A所示，不同濃度褪黑素處理組番茄果實(shí)的病斑面積均不同程度小于對照組。如圖1B所示，1、50、100、150 μmol/L褪黑素處理組在接種后3 d時(shí)的發(fā)病率比對照組分別低28.57%、28.81%、28.81%和57.14%（P＜0.05），6 d時(shí)的發(fā)病率分別比對照組低18.00%、21.66%、26.67%和36.00%（P＜0.05），隨褪黑素處理濃度的升高，果實(shí)發(fā)病率降低。如圖1C所示，接種3 d后，1、50、100、150 μmol/L褪黑素處理組的病斑面積比對照組分別低41.51%、52.03%、55.14%和58.50%（P＜0.05），6 d時(shí)的病斑面積比對照組分別低14.09%、22.61%、43.51%（P＜0.05）和5.94%。采前100 μmol/L褪黑素處理組在第6天的病斑面積最小，150 μmol/L褪黑素處理組的病斑面積與對照組無顯著性差異（P＜0.05）。綜上，采前適宜濃度的褪黑素噴施番茄植株，可以提高采后番茄果實(shí)的抗灰葡萄孢菌能力，其中100 μmol/L褪黑素處理效果最好。

2.2 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)抗病相關(guān)酶活力的影響

圖 2 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)抗病相關(guān)酶活力的影響Fig. 2 Effect of pre-harvest melatonin treatment on disease resistancerelated enzyme activities in postharvest tomato fruit

CHI是高等植物體內(nèi)水解病原菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的酶，GLU能夠降解真菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖，PPO能催化酚類物質(zhì)形成具有直接殺菌能力的醌類化合物，PAL是苯丙烷類代謝過程中的關(guān)鍵酶和限速酶，能促進(jìn)酚類、木質(zhì)素和植保素等重要抗菌物質(zhì)的合成[10-13]。如圖2A所示，采前褪黑素處理組番茄果實(shí)的CHI活力始終高于對照組，兩組活力均在貯藏7 d（168 h）時(shí)達(dá)到最大值。如圖2B所示，在采摘初期，褪黑素處理組果實(shí)的GLU活力高于對照組，在整個(gè)貯藏過程中，對照組和處理組的GLU活力都呈現(xiàn)先上升后波動下降的趨勢，均在2 h時(shí)出現(xiàn)活力高峰，處理組的GLU活力高峰值顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖2C所示，除了4 h時(shí)，在整個(gè)貯藏過程中，褪黑素處理組的果實(shí)PPO活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖2D所示，在0 h，褪黑素處理組PAL活力高于對照組，貯藏1 d時(shí)，對照組果實(shí)PAL活力到達(dá)最高值，處理組PAL活力處于最低值。之后的貯藏過程中，對照組果實(shí)的PAL活力逐漸下降，而處理組的活力逐漸上升。第7天時(shí)，處理組的GLU活力達(dá)到最高值，高于對照組最高值。以上結(jié)果表明，采前褪黑素處理提高了采后番茄果實(shí)CHI、GLU、PPO、PAL的活力。

2.3 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)抗病相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖 3 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)抗病相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the gene expression associated with disease resistance in postharvest tomato fruit

病程相關(guān)蛋白受到病原菌侵染或非生物脅迫誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生。NPR1是植物體內(nèi)水楊酸、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）抗病信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)，在水楊酸誘導(dǎo)的抗病途徑中起關(guān)鍵作用[14-15]。PI II基因是JA信號途徑上的一個(gè)重要基因[16]，而其活躍表達(dá)也說明抗病信號傳導(dǎo)與該途徑具有密切關(guān)系。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是茉莉酸途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[17]。如圖3A所示，褪黑素處理組果實(shí)基因PR1相對表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，褪黑素處理組果實(shí)PR1的相對表達(dá)量始終高于對照組，兩組基因相對表達(dá)量均在4 h時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)處理組的PR1基因表達(dá)量是對照組的2 倍。如圖3B所示，褪黑素處理組果實(shí)的NPR1相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，對照組呈現(xiàn)波動降低的趨勢。在整個(gè)貯藏過程中，處理組果實(shí)的NPR1表達(dá)量略高于對照組。如圖3C所示，在貯藏的過程中，處理組果實(shí)的PI II相對表達(dá)量高于對照組，兩組均先增后降。如圖3D所示，在貯藏2 h時(shí)，兩組LoxD相對表達(dá)量都達(dá)到了峰值，褪黑素處理組的LoxD相對表達(dá)量峰值是對照組的4 倍。貯藏2 h之后，兩組的LoxD相對表達(dá)量都驟降且趨于平穩(wěn)，褪黑素處理組的LoxD表達(dá)水平略高于對照組。

2.4 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)品質(zhì)的影響

VC、有機(jī)酸、可溶性糖和可溶性蛋白在植物的生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，且其含量是衡量果蔬營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[18-24]。如圖4A所示，褪黑素處理組和對照組VC含量均隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在整個(gè)貯藏過程中，處理組果實(shí)的VC含量始終顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4B所示，處理組和對照組可滴定酸含量的變化范圍為0.27～0.40 g/100 g，均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，從采收一直到貯藏7 d，處理組的可滴定酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖4C所示，對照組可溶性糖含量在貯藏期逐漸升高，0～1 d是緩慢上升期，1～5 d是快速上升期，5 d之后逐漸穩(wěn)定;處理組在0 d時(shí)可溶性糖含量即高于對照組，0～1 d是快速增長期，之后趨于穩(wěn)定，在貯藏過程中，處理組的可溶性糖含量均高于對照組。如圖4D所示，在貯藏過程中，處理組的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，對照組呈現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢。處理組和對照組可溶性蛋白含量的最高值分別在貯藏的1、0 d，且處理組的峰值略高于對照組，處理組可溶性蛋白含量在1 d和3 d時(shí)高于對照組。上述結(jié)果表明，采前褪黑素處理提高了采后番茄果實(shí)的貯藏品質(zhì)。

圖 4 采前褪黑素處理對采后番茄果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響Fig. 4 Effect of pre-harvest melatonin treatment on quality indicators of postharvest tomato fruit

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度褪黑素對開花之前的番茄植株進(jìn)行采前噴施，以采后綠熟期番茄果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，外源褪黑素采前處理可以降低采后番茄果實(shí)灰霉病的發(fā)病率和病斑面積，其中100 μmol/L的采前褪黑素抗病效果最好。貯藏過程中，采前褪黑素處理能夠提高果實(shí)的PAL、CHI、GLU和PPO活力，并不同程度地提高抗病相關(guān)基因（PR-1、NPR1、PI II、LoxD）的相對表達(dá)量，可初步判斷褪黑素同時(shí)通過SA和JA/ET兩條途徑導(dǎo)致植物產(chǎn)生抗病性，但其誘導(dǎo)機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

褪黑素處理采后果實(shí)能夠提高番茄[25]、草莓[26]的營養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)研究表明，褪黑素采前處理番茄植株可以提高采后果實(shí)的質(zhì)量，提高果實(shí)內(nèi)部有機(jī)酸、VC的含量[27]，與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用褪黑素采前處理能夠提高采后番茄果實(shí)的可溶性糖、可滴定酸、蛋白質(zhì)含量、VC含量的結(jié)果相一致，說明褪黑素采前處理可以一定程度上改善采后番茄果實(shí)的品質(zhì)。

綜上，在采前對番茄植株噴施適宜濃度褪黑素可有效提高采后番茄果實(shí)對灰葡萄孢菌的抗性、抗病相關(guān)酶活力和番茄的貯藏品質(zhì)。