殷爽 孫萬萬 王毅 季秀玲 張琦 魏云林

摘 ?要：對(duì)陳化煙葉的細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行高效分離及擴(kuò)增，獲得最適助分離劑和分離條件，選取在玉溪陳化，等級(jí)為WDC3F的K326煙葉為試驗(yàn)材料，使用4種不同的助分離劑對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行了分離，同時(shí)對(duì)分離的細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行了培養(yǎng)增殖，利用可培養(yǎng)和免培養(yǎng)法對(duì)培養(yǎng)前后的細(xì)菌區(qū)系多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析。結(jié)果表明，以1‰ SDS為助分離劑對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系進(jìn)行分離，分離率相對(duì)于傳統(tǒng)方法提高了489.58%。培養(yǎng)溫度為15 ℃時(shí)，使用煙葉浸液培養(yǎng)基不僅可使煙葉表面細(xì)菌總量增殖約100倍，而且可以較好地保留區(qū)系的多樣性。免培養(yǎng)分析表明，培養(yǎng)增殖前后的細(xì)菌區(qū)系結(jié)構(gòu)存在一定差異，但其細(xì)菌群落代謝功能并沒有顯著差異，這表明擴(kuò)增后的細(xì)菌區(qū)系仍然具備了原細(xì)菌區(qū)系的生理功能。本研究探索并建立了陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的高效分離方法，為陳化煙葉微生物資源的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌區(qū)系;陳化煙葉;分離;增殖;分析

Isolation and Amplification of the Microbiota from Aging Tobacco Leaves

YIN Shuang1， SUN Wanwan1， WANG Yi2， JI Xiuling1， ZHANG Qi1， WEI Yunlin1*

（1. Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China; 2. Technology Center， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650231， China）

Abstract： In order to collect microbiota efficiently from tobacco leaves during aging process and obtain the most suitable separating agent and conditions. The K326 toabacco with WDC3F grade from Yuxi area were used as the experimental material in this study. The bacterial floras of aging tobacco leaves were collected by using four separation solutions. Meanwhile， the collected bacterial flora was cultured and amplified. The bacterial flora diversity was also evaluated before and after the culture using culturable and non-culturable analysis. The results showed that an effective method for collecting microbiota of aging tobacco leaves with 1‰ SDS as a helper in separation solution was found that the collection rate was increased by 489.58% compared with the traditional method.， The tobacco leaf infusion medium supplemented with tobacco leaf extract could not only increase the total number of bacterial flora by 100 folds， but also preserve the flora diversity under the culture condition of 15 ℃. The results by non-culturable analysis showed that the structures of bacterial flora in amplified sample were changed， but there was no significant differences in the bacterial community metabolic function， which indicated that the amplified bacterial flora kept the same physiological functions as original bacterial flora. So， this study established an efficient collection and amplification method for the bacterial flora from aging tobacco leaves， which provided a basis for the development of aged tobacco leaf microorganism resources.

Keywords： microbiota; aging tobacco; microbiota collection; proliferation of bacterial biota; analysis of bacterial biota

陳化煙葉表面存在著大量的微生物，包括細(xì)菌、真菌和少量放線菌，它們所組成的微生物群落稱為“陳化煙葉微生物區(qū)系”[1-4]。研究表明微生物區(qū)系是煙葉陳化主要的生物因素之一，可通過多個(gè)途徑調(diào)節(jié)煙葉陳化過程，最終使陳化煙葉的內(nèi)在品質(zhì)得到改善，更加符合人們的使用需求[5-6]。微生物區(qū)系在陳化植物中起著重要作用。

從自然陳化的煙葉表面分離得到的微生物區(qū)系中，細(xì)菌是主要組成成分，真菌及其他微生物在陳化過程中作用十分有限。部分功能性細(xì)菌在陳化植物中的作用受到人們的關(guān)注，但從細(xì)菌區(qū)系角度進(jìn)行系統(tǒng)研究的少見報(bào)道[7-8]。植物在生長過程中產(chǎn)生非常復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，后期經(jīng)過陳化會(huì)使其轉(zhuǎn)化得更復(fù)雜，這些都影響著植物陳化過程中微生物區(qū)系的組成與分離[9-12]。目前細(xì)菌區(qū)系分離方法主要采用分步離心法和超聲破碎法。分步離心法會(huì)導(dǎo)致樣品懸浮液中的可培養(yǎng)微生物種類減少，超聲破碎法則會(huì)隨著超聲波振蕩時(shí)間的延長造成溶液中的微生物量變化，這兩種方法均不能完整的分離獲得陳化煙葉表面的細(xì)菌區(qū)系[13-15]。如何高效分離和系統(tǒng)分析陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系是亟待解決的問題。

本研究選用在玉溪進(jìn)行陳化等級(jí)為WDC3F的K326煙葉為材料，通過在分離液中添加不同助分離劑，探索助分離劑的最適濃度以及分離條件，為陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的高效分離提供理論依據(jù)，并為煙葉微生物資源開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

于2018年9—10月，采集云南省玉溪市研和縣（24°8′36″N，102°28′30″E，平均海拔2100 m）陳化等級(jí)為WDC3F的K326煙葉。

1.1.1 ?試驗(yàn)試劑與儀器 ?Mix，通用引物等由北京碩擎公司合成;16S rRNA回收試劑盒，GeneJET膠回收試劑盒，吐溫20均購自索萊寶公司;Trizol，玻璃珠（直徑0.1 mm）購自Ambion公司;基因組提取試劑盒使用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 ?試驗(yàn)培養(yǎng)基 ?LB 培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。PYGV培養(yǎng)基：Tryptone 0.25 g，酵母粉 0.25 g，25%葡萄糖 10 mL，維生素溶液 5 mL，無機(jī)鹽溶液 20 mL，定容于1 L。煙葉浸液培養(yǎng)基：酵母粉 0.5 g，胰蛋白胨 1 g，NaCl 1 g，以煙葉浸出液（取10 g煙葉用250 mL蒸餾水浸提30 min，過濾后滅菌）定容于1 L。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的分離及優(yōu)化 ?據(jù)文獻(xiàn)[26]方法分離，具體如下：稱取玉溪陳化等級(jí)為WDC3F的K326煙葉10 g，剪碎（1×1 cm）后移至裝有250 mL的分離液（NaCl 8.5 g/L，121 ℃滅菌15 min）的三角瓶中。經(jīng)搖床振蕩、過濾、離心后等梯度稀釋涂布，通過平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。以上述分離液為對(duì)照，往三角瓶中分別加入1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的SDS（m/V），研究不同濃度SDS對(duì)分離陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的影響;分別加入1‰（m/V）SDS、25顆玻璃珠、1%（m/V）吐溫20以及1%（m/V）Trizol，研究不同助分離劑對(duì)分離細(xì)菌區(qū)系的影響。

將分離液進(jìn)行等梯度稀釋，通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。同時(shí)觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行菌落種屬鑒定。

1.2.2 ?陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的增殖培養(yǎng)及培養(yǎng)基篩選 ?分別取100 L的分離液于不同的培養(yǎng)基中按表1方式培養(yǎng)后，通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)并進(jìn)行菌落種屬鑒定。

1.2.3 ?細(xì)菌區(qū)系的種屬鑒定 ?采用基因組提取試劑盒提取陳化煙葉表面微生物區(qū)系的總DNA，擴(kuò)增16S rDNA基因序列（通用引物：515F，5'-ATACTATGATACTGGCTCCA-3'，806R，

5'-AGTTACGTTGCTACGACAT-3'），切膠回收后送云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序、鑒定種屬。

1.2.4 ?陳化煙葉免培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析 ?根據(jù)所擴(kuò)增區(qū)域的特點(diǎn)，基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建文庫。通過剪切、OTUs聚類，隨后進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構(gòu)成;α多樣性分析（Alpha Diversity）揭示樣品之間的差異。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析方法

采用生物信息學(xué)軟件PICRUST數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同助分離劑對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的分離效果

2.1.1 ?不同濃度SDS分離效果 ?由圖1可知，不加SDS處理分離獲得細(xì)菌總量為0.48×103 cfu/g。在分 離液中加入1‰的SDS溶液時(shí)分離效果最好，分離獲得細(xì)菌總量為2.83×103 cfu/g，比對(duì)照組分離獲得細(xì)菌總數(shù)提高約5倍（489.58%）。而其他濃度SDS溶液也有助于細(xì)菌總數(shù)的提高。

2.1.2 ?不同種類助分離劑分離效果 ?由圖2可知，不同助分離劑對(duì)分離獲得細(xì)菌總量影響極顯著，同對(duì)照相比，1‰ SDS效果最佳、次之為玻璃珠（細(xì)菌總數(shù)提高104.57%）以及1%吐溫20（細(xì)菌總數(shù)提高19.94%），而1% Trizol具有抑制細(xì)菌生長的作用，致使細(xì)菌總數(shù)低于對(duì)照組。

2.2 ?陳化煙葉可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定

2.2.1 ?煙葉表面可培養(yǎng)細(xì)菌區(qū)系的菌落形態(tài) ?培養(yǎng)12 h后，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、大小等特征將群落分類、計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知，菌落以圓形為主，菌落顏色主要為乳白色，部分為黃色，少量為無色，最大菌落直徑為4 mm，最小菌落直徑為1 mm。

2.2.2 ?煙葉表面可培養(yǎng)微生物區(qū)系的種屬鑒定 ?煙葉可培養(yǎng)細(xì)菌區(qū)系的菌種鑒定結(jié)果見表3。16個(gè)樣品經(jīng)過16S rDNA序列基因比對(duì)后鑒定為6種菌，其中2和9號(hào)菌為克氏桿菌（Bacillus kochii），分離到的有效濃度為1×102 cfu/g;編號(hào)3，4，5，14為赫氏亞特蘭德桿菌（Atlantibacter hermannii），分離到的有效濃度為4.5×103 cfu/g;編號(hào)1，6，7，10，15為枯草芽孢桿菌（B. subtilis），分離到的有效濃度為1.5×103 cfu/g;編號(hào)11為蠟樣芽胞桿菌（B. cereus），分離到的有效濃度為50 cfu/g;編號(hào)8，12，13為B. aquimaris，分離到的有效濃度為6.84×102 cfu/g;編號(hào)16為B. megaterium，分離到的有效濃度為17 cfu/g。

6種菌分別屬于2個(gè)屬，即為芽孢桿菌屬（Bacillus）和亞特蘭桿屬（Atlantibacter），由此可見，該陳化時(shí)期的煙葉表面可培養(yǎng)微生物的優(yōu)勢(shì)菌種類比較單一。

2.3 ?陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系在不同培養(yǎng)基上的增殖效果

由表4可知，不同培養(yǎng)溫度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，經(jīng)過LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)菌區(qū)系的增殖數(shù)量最高，煙葉浸液培養(yǎng)基次之，細(xì)菌在PYGV培養(yǎng)基上不能生長。在15 ℃培養(yǎng)8 h，細(xì)菌區(qū)系經(jīng)過LB培養(yǎng)基和煙葉浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其細(xì)菌種類數(shù)量略有降低，培養(yǎng)至12 h，經(jīng)過LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種類數(shù)量再次降低，而在37 ℃培養(yǎng)8 h和12 h，細(xì)菌種類數(shù)量降低了33.33%。

綜合而言，在優(yōu)先保證促陳化菌種庫多樣性的前提下，在15 ℃使用煙葉浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h來培養(yǎng)煙葉細(xì)菌區(qū)系，總微生物的數(shù)量提高了100倍左右，增殖效果較好。

經(jīng)鑒定，陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系經(jīng)煙葉浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得5種菌（表5），即克氏桿菌（B. kochii）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽胞桿菌（B. cereus）、B. aquimaris和赫氏亞特蘭德桿菌（A. hermannii），有效濃度依次為1.03×104、4.53×105、1.39×105、6×105以及7.2×104 cfu/g。該結(jié)果與擴(kuò)增前種屬（表3結(jié)果）相比，擴(kuò)增后未獲得菌B. megaterium，細(xì)菌量總數(shù)提高約100倍，而細(xì)菌相對(duì)豐度和多樣性無明顯變化。

2.4 ?陳化煙葉免培養(yǎng)和可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

2.4.1 ?OTUs聚類及物種注釋 ?表6所示，未經(jīng)過增殖培養(yǎng)的陳化煙葉微生物Q.1經(jīng)過宏基因測(cè)序得到的OTUs數(shù)目為91條，增殖培養(yǎng)之后的微生物H.1得到的OTUs數(shù)目為21條，這說明未經(jīng)過增殖培養(yǎng)的陳化煙葉微生物具有較高的豐富度，增殖培養(yǎng)之后具有較低的豐富度。

2.4.2 ?群落結(jié)構(gòu)分析 ?在門水平上，各物種相對(duì)豐度如圖3。由圖3可知，未經(jīng)過增殖培養(yǎng)的陳化煙葉微生物（Q.1）群落在門分類水平上包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及少量的放線菌（Actinobacteria），培養(yǎng)之后的微生物（H.1）群落僅僅只包含變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，變形菌門在樣品細(xì)菌群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

2.4.3 ?群落功能相對(duì)豐度分析 ?根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本或分組在各注釋層級(jí)上最大豐度排名前10的功能信息，生成功能相對(duì)豐度柱狀堆積圖，如圖4所示。由圖4可知，未經(jīng)過培養(yǎng)增殖的陳化煙葉微生物（Q.1）和培養(yǎng)增殖之后的微生物（H.1）群落功能相對(duì)豐度與比例沒有明顯的差異。陳化煙葉微生物的功能基因主要包括：與膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因、碳水化合物代謝相關(guān)的基因、氨基酸代謝相關(guān)的基因、復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因、與細(xì)胞過程和信號(hào)傳遞相關(guān)的基因、能量代謝相關(guān)基因、輔助因子和維生素代謝相關(guān)基因、翻譯相關(guān)基因、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因以及一些其他功能的相關(guān)基因。

3 ?討 ?論

本研究發(fā)現(xiàn)添加1‰ SDS分離K326陳化煙葉表面微生物區(qū)系的效果最好。SDS是離子型表面活性劑，本身所帶的電荷可以降低微生物與灰塵顆粒或者植物之間的作用力，并且SDS具有良好的去污能力，可以溶解煙葉陳化過程中生成的油脂等黏性物質(zhì)，從而有助于微生物的分離[16-17];Trizol主要成分是苯酚，作為提取RNA的裂解劑能夠使細(xì)胞的蛋白、核酸等物質(zhì)得到釋放[18]，但是在提取過程中，Trizol也會(huì)使微生物發(fā)生死亡性裂解，導(dǎo)致微生物數(shù)量減少。吐溫20作為溶質(zhì)的助懸劑，能夠中和化學(xué)試劑對(duì)微生物的抑制作用，但是其本身的不

飽和脂肪酸也十分容易氧化降解而產(chǎn)生多種有毒成分導(dǎo)致微生物數(shù)量減少[19]。玻璃珠在振蕩過程中能使微生物從煙葉表面分離下來，但是玻璃珠對(duì)細(xì)胞具有機(jī)械破碎作用，導(dǎo)致分離效率不高。此外，本研究僅對(duì)陳化煙葉表面的好氧細(xì)菌進(jìn)行了分離，而對(duì)于陳化煙葉表面存在的厭氧菌值得在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。

在不同培養(yǎng)溫度下，經(jīng)過LB培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的豐度最高，煙葉浸液培養(yǎng)基次之，PYGV培養(yǎng)基最低;而經(jīng)過煙葉浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，微生物的多樣性最高，LB培養(yǎng)基次之，PYGV 培養(yǎng)基最低。造成這種現(xiàn)象可能是：不同培養(yǎng)基的營養(yǎng)配比不同。有研究表明，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基更有利于優(yōu)勢(shì)菌的富集，但貧培養(yǎng)基有利于微生物多樣性的保持[20-21]。相比較而言，LB培養(yǎng)基營養(yǎng)最為豐富，煙葉浸液的營養(yǎng)成分次之，PYGV培養(yǎng)基營養(yǎng)最低，這一結(jié)果與其他報(bào)道也較為相似[22]，但是有些區(qū)別，造成這一區(qū)別的原因是PYGV培養(yǎng)基的營養(yǎng)非常匱乏，短時(shí)間內(nèi)無法滿足不同細(xì)菌的快速增殖。

通過微生物可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的多樣性和豐度進(jìn)行研究。結(jié)果表明，陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系培養(yǎng)增殖前主要為芽孢桿菌屬和亞特蘭桿屬，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。浦紹占等[23]和韓錦峰等[24]發(fā)現(xiàn)，隨著陳化過程的進(jìn)行芽孢桿菌屬逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌，培養(yǎng)增殖之后主要優(yōu)勢(shì)菌是芽孢桿菌屬和亞特蘭桿屬，可以看出，在屬水平上，陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系培養(yǎng)增殖前后細(xì)菌群落的多樣性無變化，從種水平上來看，陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系培養(yǎng)增殖后與陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系培養(yǎng)增殖前相比，也只缺失了Bacillus megaterium。

同時(shí)通過微生物免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的多樣性和豐度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雖然陳化煙葉培養(yǎng)增殖前后細(xì)菌區(qū)系的多樣性和豐度存在差異，但在代謝功能上卻沒有顯著差異。未經(jīng)過培養(yǎng)增殖的陳化煙葉微生物群落在門分類水平上包括了變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及少量的放線菌（Actinobacteria），培養(yǎng)增殖之后的微生物群落僅僅只包含變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。變形菌門在樣品細(xì)菌群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，這與其他人的研究結(jié)果相似[13，25-26]。值得注意的是，本研究僅對(duì)有限的試驗(yàn)樣品進(jìn)行了分析，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)該采集不同地點(diǎn)的陳化煙葉進(jìn)行研究，為試驗(yàn)提供更完善的理論依據(jù)。

4 ?結(jié) ?論

研究表明，以1‰ SDS為助分離劑相對(duì)于傳統(tǒng)方法對(duì)陳化煙葉細(xì)菌區(qū)系的分離率提高了489.58%。免培養(yǎng)分析表明，培養(yǎng)增殖前后的細(xì)菌區(qū)系組成存在一定差異，但其代謝功能并沒有顯著差異，培養(yǎng)增殖后的細(xì)菌區(qū)系仍然具備了原細(xì)菌區(qū)系的生理功能。使用煙葉浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)可使煙葉表面可培養(yǎng)細(xì)菌增殖約100倍，并能較好地保留區(qū)系的多樣性。研究為合理利用微生物區(qū)系促進(jìn)煙葉陳化提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。如何使微生物區(qū)系更完整地分離并在不影響其群落結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下得到高效增殖，仍然值得進(jìn)一步探索。分離和培養(yǎng)增殖的細(xì)菌在煙葉陳化過程中的應(yīng)用也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]郭曉奎. 人體微生物群與微生物組[J]. 微生物與感染，2017，12（3）：132-138.

GUO X K. Human microbiota and microbiome[J]. Journal of Microbes and Infections， 2017， 12（3）： 132-138.

[2]宋曉培，宋文靜，蘆偉龍，等. 不同硫酸鉀用量對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落的影響[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（1）：33-40.

SONG X P， SONG W J， LU W L， et al. Effects of different potassium sulfate levels on bacterial community of tobacco planting soil[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（1）： 33-40.

[3]李秀妮，李猛，萬德建，等. 煙葉微生物及其在煙葉發(fā)酵和醇化中的作用研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2019，46（6）：1520-1529.

LI X N， LI M， WAN J D， et al. Role of microorganisms in tobacco fermentation and alcoholization： a review[J]. Microbiology China， 2019， 46（6）： 1520-1529.

[4]LIU F， ZHAO Z， ZHAO M Q. Detection and quantitative analysis of dominant bacteria on aging flue-cured tobacco leaves[J]. Agricultural Science & Technology， 2016， 17（11）： 2611-2614.

[5]WANG J J， XU Z C， FAN J L. Effects of X-ray irradiation on the microbial growth and quality of flue-cured tobacco during aging[J]. Radiation Physics and Chemistry， 2015， 111： 9-13.

[6]薛磊，鄭澤浩，郭志剛，等. 煙草增香細(xì)菌的篩選及其作用效果[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（5）：60-67.

XUE L， ZHENG Z H， GUO Z G， et al. Screening and application of aroma-enhancing bacteria for tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 60-67.

[7]伍雪瑩. 陳化烤煙煙葉細(xì)菌群落鑒定及應(yīng)用研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2014.

WU X Y. Identification and application study of bacterial communities on flue-cured tobacco leaves[D]. Guangzhou： South China University of Technology， 2014.

[8]關(guān)亮，李天麗，陳竹亭，等. 陳化煙葉中纖維素降解菌群的分離及其特性研究[J]. 中國煙草科學(xué)，2013，34（6）：103-107.

GUAN L， LI T L， CHEN Z T， et al. Isolation and characterization of

bacterial community with cellulose-decomposition ability from aging flue-cured tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（6）： 103-107.

[9]張繼光，申國明，張久權(quán)，等. 煙草連作障礙研究進(jìn)展[J]. 中國煙草科學(xué)，2011，32（3）：95-99.

ZAHNG J G， SHEN G M， ZHANG J Q， et al. Advance in continuous cropping problems of tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（3）： 95-99.

[10]周家喜，喻理飛，張健，等. 煙葉陳化過程細(xì)菌群落演替特征[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2018，38（21）：7739-7748.

ZHOU J X， YU L F， ZHANG J， et al. Study on the characteristics of bacterial community succession in tobacco aging [J]. Acta Ecologica Sinica，2018，38（21）： 7739-7748.

[11]梅涌，姜興濤，劉輝. 煙葉陳化中的微生物多樣性及其對(duì)煙葉品質(zhì)改良的研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（20）：3801-3803.

MEI Y， JIANG X T， LIU H. The microorganism diversity of aged tobacco and effects on improvement of tobacco quality[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2017， 56（20）： 3801-3803.

[12]吳光麗，孫瑋宏，董高峰，等. 云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過程中可培養(yǎng)真菌種群分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2018，39（3）：66-72.

WU G L， SUN W H， DONG G F， et al. Analysis of the dominant fungal population of flue-cured tobacco leaves during aging from different locations of Yunnan[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（3）： 66-72.

[13]葉建斌，閆記，劉向真，等. 原煙復(fù)烤前后細(xì)菌種群變化研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，46（1）：154-159.

YE J B， YAN J， LIU X Z， et al. Study on change of bacteria populations of raw tobacco leaves before and after redrying[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2017， 46（1）： 154-159.

[14]周家喜. 不同倉儲(chǔ)環(huán)境微生物群落對(duì)煙葉陳化品質(zhì)的影響[D]. 貴陽：貴州大學(xué)，2017.

ZHOU J X. Effects of microbial communities on quality of tobacco leaves in different storage environments[D]. Guiyang： Guizhou University， 2017.

[15]倪紅梅. 云南曬黃煙煙葉調(diào)制過程中細(xì)菌種群變化研究[D]. 昆明：昆明理工大學(xué)，2015.

NI H M. The dynamic and diversity of cultivable bacteria during leaves process of Yunnan sun-cured tobacco[D]. Kunming： Kunming University of Science and Technology， 2015.

[16]吳麗云，倪輝，李鶴賓，等. 微泡菌屬ALW5褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，2016，16（6）：79-87.

WU L Y， NI H， LI H B， et al. Characterization of alginate lyase from microbulbifer sp. ALW5 and antioxidant activity of its hydrolysates[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2016， 16（6）： 79-87.

[17]鄭鳳仙. 表面活性劑在固液界面及限制空間中的吸附和聚集行為的分子模擬研究[D]. 北京：北京化工大學(xué)，2009.

ZHENG F X. Molecular simulation study on adsorption and aggregation behaviors of surfactants in a solid liquid interface and confined space[D]. Beijing： Beijing University of Chemical Technology， 2009.

[18]CHAN K K， KWOK C S， SZE E T， LEE F W. Evaluation of the use of trizol-based protein extraction approach for gel-based proteomic analysis of dried seafood products and chinese tonic foods[J]. International journal of molecular sciences， 2018， 19（7）： 1998-2011.

[19]崔肖肖，趙素合，胡明翰，等. 吐溫20濃度對(duì)鞘氨醇單胞菌脫硫胎面膠的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2015，21（6）：1037-1043.

CUI X X， ZHAO S H， HU M H， et al. The influence of tween 20 concentration on biodesulfurization of ground tire rubber by Sphingomonas sp[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2015， 21（6）： 1037-1043.

[20]胡元森，李翠香，孫富林，等. 不同培養(yǎng)基組合提高土壤細(xì)菌可培養(yǎng)性的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（5）：882-887.

HU Y S， LI C X， SUN F L， et al. Improved culturability of soil bacteria using proper combination with various culturing medium[J]. Acta Microbiologica Sinica， 2007， 47（5）： 882-887.

[21]羅楚翔，彭建，楊歡，等. 煙草赤星病拮抗芽胞桿菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 中國煙草科學(xué)，2014，35（3）：50-55.

LUO C X， PENG J，YANG H， et al. Screening and medium optimization of antagonistic Bacillus against tobacco brown spot disease[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（3）： 50-55.

[22]李明源，王繼蓮. 新疆東帕米爾高原慕士塔格峰洋布拉克冰川雪冰及融水中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析[J]. 冰川凍土，2015，37（6）：1634-1641.

LI M Y， WANG J L. Culturable bacterial diversity in snow， ice and meltwater of the Yangbark Glacier， Muztag Ata[J]. Journal of Glaciology and Geocryology， 2015， 37（6）： 1634-1641.

[23]浦紹占. 不同倉儲(chǔ)條件對(duì)醇化煙葉品質(zhì)的影響[D]. 昆明：昆明理工大學(xué)，2017.

PU S Z. The effect of different warehouse conditions on quality of aged tobacco[D]. Kunming： Kunming University of Science and Technology， 2017.

[24]韓錦峰，葉波平. 陳化發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應(yīng)用研究[J]. 中國煙草科學(xué)，1997，18（4）：13-14.

HAN J F，YE B P. Microbial activity and application of flue-cured tobacco leaf during aging[J]. Chinese Tobacco Science， 1997， 18（4）： 13-14.

[25] 王小花，黃鶯，陳雪，等. 植煙土壤高活性氨化菌的篩選鑒定及其氨化能力分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（3）：31-38.

WANG X H， HUANG Y， CEHN X， et al. Screening， identification and ammoniation ability analysis of high activity ammonia bacteria in tobacco growing soil[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（3）： 31-38.

[26] 段玉琪，晉艷，陳澤斌，等. 烤煙輪作與連作土壤細(xì)菌群落多樣性比較[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2012，18（6）：53-59.

DUAN Y Q， JIN Y， CHEN Z B， et al. Comparison of bacteria diversity between tobacco plantation soils of rotational cropping and continuous cropping[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2012， 18（6）： 53-59.

基金項(xiàng)目：云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目“提高云南中煙煙葉可用性的研究和應(yīng)用”（2015YL0）;“煙葉生物工程技術(shù)綜合利用聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室-煙

用生物酶制劑開發(fā)研究”（S-6013067）

作者簡介：殷 ?爽（1995-），男，碩士研究生，從事煙草微生物生態(tài)與應(yīng)用研究。E-mail：448148935@qq.com。*通信作者，E-mail：homework18@126.com

收稿日期：2019-08-26 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-12