王云瓊?楊朝應(yīng)

摘 要：本次實(shí)驗(yàn)以梨休眠芽為材料研究了干燥時(shí)間、預(yù)處理時(shí)間、PVS2裝載時(shí)間及解凍方式對超低溫保存后梨休眠芽再生率的影響。結(jié)果表明，休眠芽干燥12h，先用60%PVS2預(yù)處理20min，再用100%PVS2處理20min，取出后用43℃水浴解凍3min，然后用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗，接種在再生培養(yǎng)基試管中，進(jìn)行光照培養(yǎng)，可獲得較高的萌發(fā)率。相同條件下用43℃水浴解凍比流水解凍好。

關(guān)鍵詞：梨休眠芽;超低溫保存

莖尖分生組織超低溫（-196℃）保存技術(shù)是種質(zhì)資源長期保存的理想技術(shù)，它既實(shí)現(xiàn)了對種質(zhì)資源的長期保存，同時(shí)可以快速進(jìn)行無性繁殖，減少了材料的遺傳變異性。近年來隨著國內(nèi)外對超低溫保存研究的不斷發(fā)展，逐步發(fā)展有干凍法、預(yù)培養(yǎng)法、玻璃化法、包埋脫水法等超低溫保存技術(shù)。到目前為止，采用超低溫保存技術(shù)已經(jīng)在蘋果、扁桃等近千種植物材料成功進(jìn)行了超低溫保存，超低溫保存休眠芽的效果往往比其他組織器官還好，而且容易通過叢生芽途徑再生植株。本試驗(yàn)擬對以梨休眠芽為外植體的超低溫保存進(jìn)行研究，找出有利于梨休眠芽超低溫保存的最優(yōu)方案，為梨在林業(yè)中的應(yīng)用以及梨樹種質(zhì)資源的長期保存提供支撐。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料采集時(shí)間為2018年11月中旬。長度約10cm帶休眠芽的枝條若干枝，取回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.梨休眠芽外植體滅菌。將休眠芽帶一點(diǎn)木質(zhì)部切下，剝?nèi)?～2層鱗片放入燒杯，用流水沖洗干凈后轉(zhuǎn)移到小錐形瓶中，加75%酒精清洗2次，再加無菌水清洗，而后加0.1%升汞，滴1滴吐溫-80，蓋上蓋子浸泡3min倒掉，而后加入無菌水清洗5次，時(shí)間分別30s，3min，3min，5min，3min。然后開始剝芽2mm左右，放入培養(yǎng)皿中待用。

2.培養(yǎng)基的配制及滅菌。將各種器皿洗凈放在指定位置。首先用量筒量取所需的母液按順序加入1000mL搪瓷杯中攪拌，然后加入1.5mg/L6-BA和0.5mg/LIBA，加入稱取的蔗糖和適量無菌水并不斷攪拌至溶解，加水定容到1000mL，用氫氧化鈉或稀鹽酸pH調(diào)值為6.0。加入瓊脂，在電磁爐上加熱攪拌使其完全溶解。然后將培養(yǎng)基分裝到三角瓶中并封好瓶口，放入高壓滅菌鍋滅菌中（氣壓121℃，時(shí)間18min）滅菌。滅好菌后取出培養(yǎng)基，用注射器加入0.5mg/LGA到三角瓶中，攪拌并分裝到已滅好菌的平底試管中，平放凝固后接種用。

3.實(shí)驗(yàn)處理與再生。本實(shí)驗(yàn)通過干燥時(shí)間、預(yù)處理時(shí)間、PVS2處理時(shí)間、解凍方式等4個(gè)維度進(jìn)行對照試驗(yàn)，每1個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)含10個(gè)休眠芽。經(jīng)過干燥、預(yù)處理、PVS2處理、解凍等處理過程，最后將處理后的材料用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗2次，然后進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，每1個(gè)莖尖單獨(dú)接種于含有MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉培養(yǎng)基的平底試管中，光照培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx的條件下進(jìn)行，光照時(shí)間14h/d，30d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

二、結(jié)果與分析

（一）干燥時(shí)間對超低溫保存的影響

從表1可知，不經(jīng)過干燥和干燥8h的芽全部被污染，萌發(fā)率都為0.00±0.00b。干燥12、16、20h休眠芽都有一定的萌發(fā)率，隨著干燥時(shí)間延長，休眠芽的萌發(fā)率也開始逐漸降低，到20h的時(shí)候，萌發(fā)率只有43.33±0.15a。干燥時(shí)間長短對休眠芽超低溫保存后萌發(fā)率有一定的影響。干燥12h梨樹休眠芽萌發(fā)率最高，為60.00±0.17a。由此可以得出干燥12h為梨休眠芽萌發(fā)的最佳時(shí)間。

（二）預(yù)處理時(shí)間對超低溫保存的影響

從表2可以看出，以干燥20h的休眠芽為材料進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理10min，萌芽率最高，可達(dá)到56.67±0.05a，不經(jīng)過預(yù)處理和預(yù)處理20min的萌芽率都低于預(yù)處理10min的萌芽率相同，經(jīng)過預(yù)處理10min的休眠芽恢復(fù)培養(yǎng)后植株生長勢良好。由此得出，同等條件下預(yù)處理10min對梨休眠芽萌發(fā)最佳。

（三）PVS2處理時(shí)間對超低溫保存的影響

從表3可以得出，同樣以干燥20h的休眠芽為材料，不經(jīng)過PVS2處理萌發(fā)率可到達(dá)46.67±0.11a，處理10min和處理20min的污染率更高，PVS2處理時(shí)間過長，對休眠芽有一定的傷害，導(dǎo)致萌芽率的降低。

（四）不同解凍方式對超低溫保存的影響

從表4可知，水浴解凍方式萌芽率可達(dá)到43.33±0.12，而相同條件下流水解凍方式的萌芽率只有36.67±0.23，由此的出，對于梨休眠芽超低溫保存的萌發(fā)率來說，水浴解凍方式優(yōu)于流水解凍的方式。

三、討論

適當(dāng)?shù)母稍飼r(shí)間對梨休眠芽超低溫保存后休眠芽的萌發(fā)率有一定的提高。含水量的多少直接影響超低溫保存是實(shí)現(xiàn)超低溫保存的關(guān)鍵，不同植物的超低溫保存適宜含水量不同。本實(shí)驗(yàn)主要是探討干燥時(shí)間對梨休眠芽萌發(fā)率的影響，通過本次實(shí)驗(yàn)研究得梨休眠芽最佳干燥時(shí)間為12h，萌發(fā)率為60%。預(yù)處理時(shí)間對梨休眠芽超低溫保存后的萌發(fā)率有不同程度的影響，通過實(shí)驗(yàn)分析，60%PVS2預(yù)處理和PVS2同時(shí)處理20min，梨休眠芽的萌發(fā)率可到60%。

解凍方式的不同對超低溫保存后梨休眠芽的萌發(fā)也有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)分析得出，相同條件下水浴解凍后梨休眠芽的萌發(fā)率高于流水解凍的萌發(fā)率，得出水浴解凍方式優(yōu)于流水。

梨休眠芽經(jīng)過超低溫保存的萌發(fā)率高，而且再生植株的遺傳性也很穩(wěn)定，生長勢良好，因此可以作為一種長久有效保存休眠芽的方法。

參考文獻(xiàn)：

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