摘 要：建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。選擇牛、羊線粒體16SrRNA靶序列，設(shè)計(jì)合成引物和探針，鑒別羊乳制品中的羊乳成分。結(jié)果表明，該方法最低可檢測(cè)摻入2.0%牛源性成分的羊奶制品，具有靈敏、快速、高效以及高通量等優(yōu)勢(shì)，可作為羊奶制品羊乳成分摻假鑒別手段之一。

關(guān)鍵詞：羊乳制品摻假；牛乳；實(shí)時(shí)熒光PCR；Taqman探針?lè)?/p>

羊乳制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)的相關(guān)研究表明，羊乳含有200多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性因子，其蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素的總含量均高于牛乳[1]。羊乳中蛋白質(zhì)凝塊細(xì)而軟，脂肪顆粒較小，易消化吸收[2]，人體對(duì)羊乳的吸收率在94%以上，特別適合嬰幼兒、老年人和身體虛弱者飲用。營(yíng)養(yǎng)成分組成及基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)、各營(yíng)養(yǎng)元素配比以及營(yíng)養(yǎng)特性都與母乳最為接近，因此在嬰幼兒食品中優(yōu)勢(shì)明顯。同時(shí)羊乳中不含過(guò)敏性蛋白，不易出現(xiàn)過(guò)敏等現(xiàn)象，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家推薦為牛乳過(guò)敏人群的最佳替代乳品[3-4]。近年來(lái)，羊乳相關(guān)產(chǎn)品的流行已漸成趨勢(shì)，市場(chǎng)上產(chǎn)品種類越來(lái)越多，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，一些不法商販和企業(yè)在羊乳中摻入牛乳以降低成本，牟取暴利。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)從基因水平分析物種來(lái)源，Taqman real-time PCR法具有靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

鮮羊乳來(lái)自內(nèi)蒙古蒙恩公司純羊奶，牛乳來(lái)自市售伊利集團(tuán)有限公司。

1.1.2 主要儀器和材料

儀器：實(shí)時(shí)熒光PCR儀（Quant StudioTM 7 Flex）購(gòu)于賽默飛世爾公司，超微量紫外分光光度計(jì)（Nano drop one）購(gòu)于賽默飛世爾公司。

試劑：PCR引物和探針（上海生工生物工程有限公司合成）；Wizard磁珠法食品DNA純化系統(tǒng)（貨號(hào)：FF 3751）由美國(guó)Promega生物技術(shù)公司生產(chǎn)；Probe qPCR mix（貨號(hào)：RR391A）TakaRa（中國(guó)）寶日生物公司；Real-time PCR Bovine DNA Detection Kit（貨號(hào)：RR910）TakaRa（中國(guó)）寶日生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫脂樣品的制備

新鮮奶粉中脂肪含量較高，需要先去除脂肪純化樣品[6]。樣品冷藏1～2 h，2 000 g離心5 min，去除上層脂肪。若為脫脂樣品則直接用于DNA提取。

1.2.2 DNA的提取

乳制品中DNA含量低，因此稱取脫脂后樣品1 g放入50 mL離心管中，之后按照提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行操作，最后用50 μL無(wú)核酸酶水洗脫，洗脫步驟可分多次洗脫，以提高回收率。提取后的樣品經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，DNA濃度為752 ng/mL和810 ng/mL，于4 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

采用Prmimer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)Blast比對(duì)后選取特異性引物和探針。牛源性引物及探針均采用TakaRa公司試劑盒。引物探針序列見(jiàn)表1。

1.2.4 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

25μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL qPCR mix（2×），0.5 μL上下游引物，1μL探針，2 μL模板，8.5 mL ddH20。

PCR上機(jī)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳DNA中羊源性成分、牛源性成分特異性檢測(cè)

選取線粒體基因組參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)羊源性特異性引物因?yàn)榧棺祫?dòng)物線粒體基因在物種間特異性強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在羊源性引物中加入羊源性引物探針，牛源性引物中加入牛源性引物探針觀察到明顯擴(kuò)增曲線，如圖1。

在交叉模板中未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。證明所設(shè)計(jì)的引物和探針具有較為明顯的特異性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)牛、羊引物探針的特異性所建立的基于Taqman探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR可以用于羊奶中羊源性成分特異性檢測(cè)。

此外，乳制品在加工中DNA有所降解，為了解不同提取方法對(duì)羊乳DNA的適用性，在提取DNA時(shí)選用普通動(dòng)物源性DNA提取試劑盒，Wizard磁珠法食品DNA富集提取等方法進(jìn)行比較，結(jié)果證明當(dāng)模板DNA含量低時(shí)，利用磁珠富集法提取更適合于乳制品的檢測(cè)。

2.2 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)羊乳中DNA檢測(cè)靈敏度

驗(yàn)證Real-time PCR法能夠檢測(cè)出牛、羊乳中DNA質(zhì)量濃度的最低值，考慮到乳制品中復(fù)雜體系及乳細(xì)胞分布不均的情況，并且市售產(chǎn)品多為直接將牛乳摻入羊乳中，因此采用將不同比例牛乳摻入羊乳中為樣品，稀釋成濃度梯度為含牛乳比例100%、50%、10%、5%、2%與1%，結(jié)果證明，當(dāng)摻入2%牛乳時(shí)ct值為32.25，當(dāng)濃度為1%時(shí)，無(wú)擴(kuò)增曲線，因此最低摻假檢測(cè)靈敏度為2%。如圖3。

3 結(jié)語(yǔ)

本文依據(jù)羊線粒體基因的差異設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了快速鑒別羊乳摻假的Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低摻偽檢出限為2.0%，并選用磁珠法提取，能夠較好的滿足市售摻偽產(chǎn)品鑒別的需求。此法特異性高、靈敏度強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)羊乳制品中羊源性、牛源性成分，為市售商品的監(jiān)管提供快速準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)

[1]Ceballos l s， Morsles e r， Asarve g t， et al.Composition of goat and cow milk produced under similar conditions and analyzed by identical metyodology[J]. Journal of Food Composition and Analysis， 2009， 22（4）：322-329.

[2]Mininni a， Pellizzari c， Cardazzo b， et al.Evaluation of real-time PCR assays for detection and quantification of fraudulent addition of bovine milk to caprine and ovine milk for cheese manufacture[J]International Dairy Journal，2009，19（10）：617-623.

[3]Park YW，M.Juarez b， M Ramos，et al.Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk[].Small Ruminant Research，2007，68（1）：88-113.

[4]Park YW.Hypo-allergenic and therapeutic significance of goat milk [J]. Small Rumin Res，1994，14（14）：151-159.

[5]Koppel R，Jurg R. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef，pork，horse and sheep[J]. European Food Research and Technology，2011，232（6）：151-155.

[6]黎穎，巫賢，林波，等.羊乳及其制品中摻入牛屬牛乳和水牛乳的檢測(cè)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015（5）：977-981.

作者簡(jiǎn)介：張艷茹（1988—），女，滿族，內(nèi)蒙古包頭人，本科，助理工程師。研究方向：分子生物技術(shù)檢測(cè)。