梁沛余，馬曉雨，常秀君，韓蕙竹，夏曉曉，解安達(dá)，吳 穹#

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000)

目前影響低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Low-grade gliomas，LGG)預(yù)后的因素不明。有研究顯示，僅存在癲癇表現(xiàn)的LGG患者相比于其他臨床表現(xiàn)患者具有更高的存活率，術(shù)前存在癲癇史患者相比于無癲癇史患者具有更好的臨床預(yù)后結(jié)果[1-2]，說明癲癇史可能是影響臨床預(yù)后的重要因素。對(duì)于此現(xiàn)象，有學(xué)者從行為決策角度認(rèn)為癲癇的發(fā)作可能會(huì)促進(jìn)患者早期就醫(yī)而及時(shí)獲得相關(guān)治療，而頭痛、感覺異常等其他神經(jīng)表現(xiàn)易被忽視[3]。本課題組從腫瘤病理生理角度推測(cè)，癲癇史對(duì)LGG預(yù)后的影響可能依賴于腦腫瘤獨(dú)特的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，但目前癲癇相關(guān)基因在LGG預(yù)后中的作用尚不清楚。本研究擬利用生物信息學(xué)高通量篩選LGG相關(guān)癲癇基因，并通過聯(lián)合多數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵癲癇基因?qū)GG患者預(yù)后的影響，并初步探討其可能作用機(jī)理。

1.資料與方法

1.1 資料

GSE32534基因芯片數(shù)據(jù)[4]獲取于NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，是基于GPL570平臺(tái)的[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array轉(zhuǎn)錄本，種屬為人源，芯片樣本信息共計(jì)10例，其中LGG伴有癲癇樣本5例(2例星形細(xì)胞瘤，2例神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤，1例少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、LGG無癲癇樣本5例(1例星形細(xì)胞瘤，3例神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤，1例少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。本研究選用全部芯片結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1 LGG癲癇相關(guān)基因篩選

用GEO2R算法比對(duì)篩選差異基因，以P<0.05且Fold Change>1.5為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)；下載NCBI-gene、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)癲癇基因，獲取多數(shù)據(jù)庫(kù)人癲癇共有基因；將芯片差異基因與多數(shù)據(jù)庫(kù)人癲癇共有基因比對(duì)，用Bioinformatics & Evolutionary Genomics軟件在線繪制Venn圖，得到最終的LGG癲癇相關(guān)基因。

1.2.2 基因本體論(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析

將LGG癲癇相關(guān)基因上傳DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行GO功能分析，分析模塊包括生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能。隨后行KEGG通路分析(基因在相關(guān)信號(hào)的富集情況)，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein protein interaction network，PPI network)構(gòu)建和Hub基因篩選分析

將LGG癲癇相關(guān)基因上傳STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/cgi/input.pl)，構(gòu)建PPI network，用Cytoscape軟件的MCODE插件篩選核心子網(wǎng)模塊、CytoHubba插件篩選Hub基因；利用GEIPA數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)對(duì)Hub基因在低/高級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)情況及基因間表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 LGG預(yù)后分析

以高級(jí)別膠質(zhì)瘤為對(duì)照，利用GEIPA數(shù)據(jù)庫(kù)觀測(cè)Hub基因表達(dá)對(duì)LGG患者存活率的影響。

1.2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析和經(jīng)典標(biāo)志物相關(guān)性驗(yàn)證

利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)分析Hub基因與LGG中T、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性；挑選相關(guān)性最高的免疫細(xì)胞，利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//linkedomics.org/login.php)對(duì)Hub基因與免疫細(xì)胞亞群標(biāo)志物的相關(guān)性做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.結(jié)果

2.1 LGG癲癇相關(guān)基因篩選與分析

芯片GSE32534經(jīng)GEO2R標(biāo)準(zhǔn)化處理后，形成可視化火山圖(Epilepsy Vs No epilepsy)(圖1A)，可獲得差異基因1304個(gè)(圖1B)；聯(lián)合NCBI-Gene、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得多庫(kù)人癲癇基因422個(gè)，芯片差異基因與422個(gè)基因比對(duì)可得到LGG癲癇相關(guān)基因46個(gè)(圖1C)；對(duì)LGG癲癇相關(guān)基因GO功能分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集在關(guān)鍵啟動(dòng)子序列特異性結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等過程(圖1D)，對(duì)KEGG通路分析顯示，其主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體互作信號(hào)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號(hào)、谷氨酸能突觸信號(hào)等通路(圖1E)。

A.基因芯片火山圖；B.差異基因數(shù)量；C.癲癇相關(guān)基因篩選Venn圖；D.GO功能分析圖；E.KEGG通路富集分析圖

2.2 LGG癲癇相關(guān)Hub基因篩選與驗(yàn)證

為探究蛋白互作情況，用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建LGG癲癇相關(guān)基因PPI network，發(fā)現(xiàn)39個(gè)基因節(jié)點(diǎn)及101條邊所形成如圖2A所示的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)含3個(gè)核心子網(wǎng)模塊(圖2BCD)；用CytoHubba插件多算法篩選前10位Hub基因(表1)，比對(duì)Venn圖后發(fā)現(xiàn)SYN1、GRIN2B、GRIA2、MAPT、SLC1A2、GRM5、RBFOX3、NRXN1為共有Hub基因(圖2E)，其主要富集于核心子網(wǎng)1和3，在LGG伴癲癇樣本中呈上調(diào)趨勢(shì)(圖2F)；現(xiàn)認(rèn)為L(zhǎng)GG相比于高級(jí)別膠質(zhì)瘤更易發(fā)癲癇[5]，Hub基因在低/高級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)情況如圖2G，其在LGG中存在更高表達(dá)，符合易發(fā)癲癇趨勢(shì)；同時(shí)，各Hub基因間在LGG中存在不同程度的正向調(diào)控作用(圖2H)，可形成PPI network(圖2I)。

表1 CytoHubba插件篩選候選Hub基因

A.LGG癲癇相關(guān)基因PPI network；B.核心子網(wǎng)1；C.核心子網(wǎng)2；D.核心子網(wǎng)3；E.多算法篩選Hub基因Venn圖；F.芯片Hub基因表達(dá)情況；G.不同級(jí)別膠質(zhì)瘤Hub基因表達(dá)情況；H.各Hub基因間表達(dá)相關(guān)性；I.Hub基因PPI network

2.3 LGG癲癇相關(guān)Hub基因?qū)GG患者存活率的影響

利用GEIPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析各Hub基因表達(dá)與LGG患者存活率關(guān)系發(fā)現(xiàn)，SYN1、GRIN2B、GRIA2、MAPT、GRM5、RBFOX3、NRXN1等七個(gè)Hub基因的高表達(dá)與LGG患者更高存活率有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高表達(dá)SLC1A2亦呈現(xiàn)存活率提高趨勢(shì)(圖3A)；為探究Hub基因影響LGG患者存活率的特異性，通過對(duì)照研究分析Hub基因表達(dá)與高級(jí)別膠質(zhì)患者存活率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者存活率間無顯著關(guān)聯(lián)。

2.4 LGG癲癇相關(guān)Hub基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析

B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與LGG患者存活率間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4A)。用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析Hub基因與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，八個(gè)Hub基因與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)間均存在不同程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明Hub基因高表達(dá)可能通過影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)提高LGG患者存活率。

2.5 LGG癲癇相關(guān)Hub基因與免疫細(xì)胞亞群浸潤(rùn)相關(guān)性分析

Hub基因與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性最高(圖5A)；CD4+T細(xì)胞不同亞群對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)歸的作用不同甚至相反，Hub基因與CD4+T細(xì)胞不同亞群標(biāo)志物的相關(guān)性分析結(jié)果顯示Hub基因與Treg標(biāo)志物存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖5B)，而Treg標(biāo)志物的上調(diào)會(huì)惡化LGG患者預(yù)后(圖5C)，說明CD4+T細(xì)胞亞群Treg可能在Hub基因調(diào)控LGG患者預(yù)后過程中發(fā)揮重要作用。

A.Hub基因?qū)GG患者存活率的影響；B.Hub基因?qū)Ω呒?jí)別膠質(zhì)瘤患者存活率的影響

A.不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)LGG患者存活率的影響；B.Hub基因表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

A.各免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性比較；B.Hub基因與CD4+T細(xì)胞亞群標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)性；C.細(xì)胞亞群標(biāo)志物表達(dá)對(duì)LGG患者存活率的影響

3.討論

LGG在腦膠質(zhì)瘤中約占成年人的15%、兒童的25%，隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展部分或向高級(jí)別膠質(zhì)瘤惡化，最終可致神經(jīng)功能障礙甚至死亡，故深入分析LGG預(yù)后影響因素對(duì)于認(rèn)識(shí)、防控LGG的進(jìn)展具有重要意義。LGG是致癇性最強(qiáng)的腫瘤之一，癲癇控制亦是腫瘤治療中的重要組成部分[6]。合并癲癇史的LGG患者相比無癲癇患者有著更高的生存率[2]，提示癲癇發(fā)生可能影響LGG患者預(yù)后，但其分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。本研究利用生物信息學(xué)方法探究癲癇關(guān)鍵基因與LGG患者預(yù)后之間的關(guān)系，并初步分析其與多種免疫細(xì)胞及亞群浸潤(rùn)的相關(guān)性。

我們的研究結(jié)果顯示，LGG癲癇的發(fā)生與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、軸突延伸的正向調(diào)控等生物學(xué)過程，谷氨酸能突觸信號(hào)等通路關(guān)系密切。既往研究顯示，LGG并發(fā)癲癇與腫瘤類型、部位、病理分級(jí)等有關(guān)[7]，腦腫瘤向四周侵襲增殖過程中需伴隨谷氨酸的濃度提升，谷氨酸可引起皮層興奮性增高，γ-氨基丁酸的失平衡會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白改變，提高胞外鉀離子濃度，最終誘發(fā)癲癇發(fā)作[5]，與我們的研究結(jié)果相符。PI3K-Akt信號(hào)是膠質(zhì)瘤進(jìn)展的關(guān)鍵通路，其活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂，并上調(diào)Bcl-2等蛋白發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，加速腫瘤向周圍的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]；而在癲癇模型中PI3K-Akt信號(hào)呈抑制狀態(tài)，如大麻素受體等分子可通過促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)的活化改善星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性發(fā)揮抗癲癇作用[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)伴有癲癇相比于不伴有癲癇LGG患者PI3K-Akt信號(hào)相關(guān)蛋白呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，提示癲癇發(fā)生可能通過作用PI3K-Akt通路抑制腫瘤進(jìn)一步進(jìn)展，從而改善LGG患者預(yù)后。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在腦腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)分析我們發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與LGG患者的較差預(yù)后有關(guān)。目前認(rèn)為，Treg介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤發(fā)生免疫耐受和逃逸的重要機(jī)制[10]，Treg可通過以下途徑發(fā)揮功能：(1)利用表面CTLA-4與靶細(xì)胞受體相互作用，抑制效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷；(2)分泌大量免疫抑制分子如IL-10、TGF-β等，抑制相關(guān)免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷清除能力；(3)影響抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈功能；(4)抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的聚集。實(shí)驗(yàn)研究顯示，Treg隨著腦膠質(zhì)瘤的惡性程度增高及復(fù)發(fā)率顯著提升而影響預(yù)后，清除Treg能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]，這些結(jié)果提示癲癇的發(fā)生可能通過相關(guān)基因抑制Treg的浸潤(rùn)，改善腫瘤微環(huán)境，提高LGG患者存活率。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)探究了癲癇發(fā)生影響LGG患者預(yù)后的可能分子調(diào)控機(jī)制，并篩選出SYN1、GRIN2B、GRIA2、MAPT、SLC1A2、GRM5、RBFOX3、NRXN1等八個(gè)與LGG患者預(yù)后相關(guān)的癲癇關(guān)鍵基因，為豐富LGG預(yù)后分子調(diào)控機(jī)制提供了一定的研究依據(jù)。但由于腦腫瘤信號(hào)功能轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性，其具體分子調(diào)控過程仍有待進(jìn)一步深入研究。