ADD2基因rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性與藏、漢民族高原高血壓發(fā)生的相關(guān)性※

汪曉洲，劉玉林，姚京豫，邊惠萍，楊 蕾，徐效龍，白 潔，韓 瓊，嚴(yán) 萍，張 晶，周 茜，趙彩蓮，朵 杰，馬占青，張 偉

(1.青海省心腦血管病?？漆t(yī)院高血壓科；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；3.首都醫(yī)科大學(xué)；4.高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

內(nèi)收蛋白(adducin，ADD)是一種細(xì)胞膜骨架蛋白，Martin L等人的實(shí)驗(yàn)證明，ADD基因家族的突變能引起小鼠的高血壓，小鼠β-adducin(ADD2)缺失會(huì)導(dǎo)致血壓的改變[1]。對(duì)Milan高血壓大鼠模型的研究顯示，ADD可通過增強(qiáng)Na+-k+-ATP酶活性，增加腎小管對(duì)鈉的重吸收來造成高血壓[2]。因此，在高鹽攝入與高血壓之間的因果關(guān)系中，ADD 是候選基因之一。rs3755351是ADD2基因內(nèi)含子上一個(gè)A>C 變異位點(diǎn)，對(duì)多個(gè)人群的研究提示，ADD2基因與高血壓的遺傳易感性存在一定相關(guān)性，但在不同種族和地域人群中的分布有較大的差異[3，4]，本研究旨在分析ADD2基因rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性與藏、漢民族高原高血壓(altitude-related hypertension，ARH)發(fā)生的相關(guān)性，為完善ARH發(fā)病機(jī)制研究提供新的樣本。

1.對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇2017年2月至2018年12月在青海省心腦血管病?？漆t(yī)院高血壓科住院治療的ARH患者，并根據(jù)民族分為藏族組和漢族組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①高度懷疑繼發(fā)性高血壓者；②合并其他系統(tǒng)疾病，可能對(duì)結(jié)果造成干擾者。

本研究共納入ARH樣本128例，其中漢族74例，藏族54例；健康對(duì)照樣本256例，其中漢族148例，藏族108例。四組患者年齡、居住地海拔、性別等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，資料具有可比性(表1、2)。

表1 ARH組和健康對(duì)照組一般資料

續(xù)表：

表2 ARH組和健康對(duì)照組居住地海拔分布(%)

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本收集

研究對(duì)象禁食12 h，次日6：30～7：30采肘靜脈血2 mL(EDTA抗凝，-80℃凍存)。

1.2.2 DNA提取

用全基因組DNA 提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，北京天根生物科技有限公司)提取DNA。使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測OD值。應(yīng)用1.25%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量。DNA質(zhì)檢合格后轉(zhuǎn)移至96孔板，置-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)染色體2p13區(qū)ADD2基因rs3755351位點(diǎn)，采用Assay Design 3.1軟件行PCR引物和單堿基擴(kuò)展引物設(shè)計(jì)，由上海英駿生物公司(Invitrogen)合成。其中rs3755351 PCR特異性擴(kuò)增引物為5′-ACGTTGGATGCACACATTTTGTGTTCAGCG-3′，5′- CGTTGGATGCTGAGATTATAAGTGGCTCC-3′，單堿基延伸引物為5′-CCCCCAGCGACAGTATCTCTTTA-3′。

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，本文獲取的1 030篇文獻(xiàn)分別分布在30種期刊上(如圖2)。其中，刊載武術(shù)文化研究50篇以上的期刊有5本，共刊載了442篇，占據(jù)了所有文獻(xiàn)的將近一半。期刊《體育文化導(dǎo)刊》載文量最多，達(dá)到113篇，其次是《武漢體育學(xué)院學(xué)報(bào)》，發(fā)文量為104篇?！冻啥俭w育學(xué)院學(xué)報(bào)》、《北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)》、《上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)》的發(fā)文量都在50篇以上。并且，除了體育類期刊以外，武術(shù)文化研究的文獻(xiàn)還分布在了教育類、新聞?lì)愐约爸腥A文化研究的期刊中，比如《教育理論與實(shí)踐》、《傳媒》、《中國教育學(xué)刊》、《中華文化論壇》等?？梢?，武術(shù)文化研究受到不同領(lǐng)域刊物的重視，體育類期刊對(duì)于該主題的研究更為關(guān)注。

1.2.4 SNP分型

利用MassARRAY?SNP分型技術(shù)對(duì)ADD2基因rs3755351位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

ADD2 基因rs3755351位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明研究群體具有代表性(表3)。

表3 ARH組和健康對(duì)照組的rs3755351位點(diǎn)基因型分布(%)和Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，在漢族ARH組中，ADD2基因rs3755351位點(diǎn)CC、CA、AA基因型分布頻率分別為47.3%、39.2%、13.5%，其中等位基因C、A的分布頻率分別為66.9%、33.1%；與同民族健康對(duì)照組比，其基因型的分布頻率和等位基因C、A的分布頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在藏族ARH組中，ADD2基因rs3755351位點(diǎn)CC、CA、AA基因型分布頻率分別為20.4%、57.4%和22.2%，其中等位基因C、A的分布頻率分別為49.1%、50.9%，與同民族健康對(duì)照組比，其基因型的分布頻率和等位基因C、A的分布頻率均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此外，藏族ARH與漢族ARH比，其基因型和等位基因分布頻率也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在藏族ARH患者ADD2基因rs3755351位點(diǎn)基因型的分布中，C/C基因型占比較健康對(duì)照明顯為低，相應(yīng)的A/A基因型比例有所升高。

3.討論

高血壓是最常見的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，收縮壓每升高20 mmHg或舒張壓每升高10 mmHg，心、腦血管病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)倍增[6]?，F(xiàn)有的研究證據(jù)顯示[7]，高原低氧地區(qū)高血壓的患病率較高，青藏高原地區(qū)高血壓的患病率為18.60%～40.68%。ARH和原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是高原地區(qū)高血壓最主要的兩種表現(xiàn)形式，其中ARH是高原地區(qū)特有的疾病，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制研究不足。

高原居民飲食習(xí)慣特殊，喜食高鹽食品，食鹽攝入量明顯為高。調(diào)查發(fā)現(xiàn)[8]，高原居民食鹽攝入量是WHO建議量的4～5倍。

ADD是細(xì)胞膜骨架的主要組成成分，由α、β、γ三個(gè)亞單位組成異二聚體，三個(gè)亞基分別由位于三條不同染色體上的基因ADD1、ADD2和ADD3編碼[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADD基因家族的突變可以增加腎小管基底膜Na+-K+-ATP酶活性，致腎小管上皮細(xì)胞對(duì)Na+的重吸收增加，從而導(dǎo)致高血壓[10]。遺傳流行病學(xué)研究提示，ADD可能是鹽敏感型EH的易感基因[10，11]。

Tikhonoff等人的一項(xiàng)研究[12]認(rèn)為，ADD2基因C1797T位點(diǎn)突變與高鹽攝入人群的血壓升高有關(guān)。然而，對(duì)我國EH發(fā)病率最低的彝族和哈尼族人群的研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)民族的病例組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)突變純合子(TT)的分布，ADD的T等位基因突變率很低，提示彝族和哈尼族人群C1797T多態(tài)性的缺失可能與EH的發(fā)病無關(guān)[13]。

Kato等[14]通過對(duì)高血壓的三層次、高密度的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs3755351位點(diǎn)是ADD2基因的一個(gè)A>C變異位點(diǎn)，與高血壓的易感性顯著相關(guān)(P=1.7×10-5)，該位點(diǎn)有AA、AC、CC三種基因型。對(duì)福建和廣東共計(jì)940例高血壓患者和944名健康體檢者rs3755351位點(diǎn)行基因分型發(fā)現(xiàn)：在福建人群中攜帶AA基因型能夠顯著降低高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而在廣東人群中，三種基因型的分布在病例組和對(duì)照組中無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)rs3755351多態(tài)位點(diǎn)與高血壓的遺傳易感性有關(guān)[4]，說明ADD2基因多態(tài)性與高血壓之間的遺傳易感性存在一定相關(guān)性，但在不同的種族和地域人群中存在差異。

本課題對(duì)藏、漢族ARH患者和同民族健康對(duì)照者進(jìn)行ADD2基因分型研究的結(jié)果顯示，藏族ARH組患者ADD2基因的rs3755351位點(diǎn)呈陽性，AA、CA基因型比例高于健康對(duì)照組及漢族ARH組，等位基因A的分布頻率高于健康對(duì)照組和漢族ARH組，提示攜帶更多的A等位基因與青海地區(qū)藏族ARH發(fā)生相關(guān)，而在該地區(qū)漢族ARH患者中，并未發(fā)現(xiàn)ADD2基因的rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性與ARH之間的關(guān)聯(lián)，說明ADD2基因多態(tài)性與ARH的遺傳易感性存在一定相關(guān)性。

綜上所述，ADD2 rs3755351位點(diǎn)多態(tài)性可能與藏族ARH的發(fā)生有關(guān)，是世居藏族ARH發(fā)生的易感基因之一；在移居漢族中未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)，移居漢族ARH的發(fā)生可能與其他基因位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，或與移居后對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)不全有關(guān)，機(jī)制有待闡明。