唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究※

華玉美多，南星梅，楊占婷，蘇姍姍，李占強(qiáng)*，蘆殿香**

[1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；4.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海省食品安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810003]

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，唐古紅景天活性部位具有顯著的血管舒張活性，能夠顯著干預(yù)低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成；并明確了活性部位的主要化學(xué)成分。[1-3]盡管對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了一些研究，但仍不清晰?；诖?，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，以期揭示唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的具體作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供線索。

1.資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http：//new.swisstargetprediction.ch/)[4]；PubChem數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Genecard數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//www.genecards.org/)[5]；UniProt數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//www.uni prot.org/)；STRING數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https：//string-db.org/)；KEGG數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：http：//www.genome.jp/kegg)。Venny2.1.0軟件；Cytoscape3.6.1軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物的篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

借助PubChem數(shù)據(jù)庫獲取唐古紅景天活性部位38個(gè)主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)(SMILES格式)，并導(dǎo)入Swiss Target Prediction服務(wù)器進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并以靶點(diǎn)相關(guān)概率值≥0.2為標(biāo)準(zhǔn)[6]篩選化合物及相關(guān)靶點(diǎn)。利用Perl語言通過UniProt后臺(tái)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋。登錄GeneCards網(wǎng)站，以“pulmonary hypertention”“pulmonary arterial hypertention”“hypoxic pulmonary hypertention”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索獲得肺動(dòng)脈高壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)，獲取相關(guān)度得分最高的500個(gè)靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)基因驗(yàn)證。將獲得的唐古紅景天化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與肺動(dòng)脈高壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)運(yùn)用Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖，獲得唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的作用靶點(diǎn)。

1.2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建與分析

登錄STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple protenis”項(xiàng)分析，上傳唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的作用靶點(diǎn)，選擇物種為“Homo sapiens”，篩選綜合評(píng)分≥0.4的蛋白相互作用參數(shù)，其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，獲得藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及TSV文本數(shù)據(jù)。利用R語言對(duì)得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白互作次數(shù)分析。

1.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

借助R語言調(diào)用“org.Hs.eg.db”(人類全基因組注釋)程序包將基因symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，再借助R語言調(diào)用bioconductor(http：//www.bioconductor.org/install/)[7]軟件包中的“dose”“clusterProfiler”“pathview”開放源代碼并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫及Perl語言進(jìn)行作用靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.4 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

整理化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，使用Perl對(duì)節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行屬性標(biāo)識(shí)，獲得節(jié)點(diǎn)屬性文件。并將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。得到唐古紅景天活性成分干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的“化合物-靶點(diǎn)-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.結(jié)果

2.1 唐古紅景天活性成分干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的潛在靶點(diǎn)篩選

通過Swiss Target Prediction服務(wù)器利用反向藥效團(tuán)匹配方法，獲得唐古紅景天活性部位主要化學(xué)成分的141個(gè)作用靶點(diǎn)(probability value≥0.2)。利用Venny 2.1.0軟件將141個(gè)作用靶點(diǎn)與從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取的前500個(gè)肺動(dòng)脈高壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集篩選，獲得唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓潛在作用靶點(diǎn)(圖1)及其化合物與作用靶點(diǎn)信息(表1)。

圖1 唐古紅景天-肺動(dòng)脈高壓共同靶基因的韋恩圖

表1 唐古紅景天化合物對(duì)應(yīng)靶基因信息表

2.2 唐古紅景天活性成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI的構(gòu)建與分析

為進(jìn)一步分析唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的作用機(jī)制，在STRING數(shù)據(jù)庫錄入38個(gè)靶蛋白，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI圖(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中38個(gè)靶點(diǎn)都存在相互作用，無游離蛋白，38個(gè)節(jié)點(diǎn)相互作用產(chǎn)生了251條蛋白互作邊，平均節(jié)點(diǎn)度數(shù)為13.2。其中互做邊最多的20個(gè)靶點(diǎn)如圖3所示，TNF、AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9、MAPK14、ESR1、HRAS等節(jié)點(diǎn)蛋白互作次數(shù)顯著高于其他節(jié)點(diǎn)，提示這些靶蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中比較重要，推測(cè)其可能是唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 核心靶蛋白柱狀圖

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/index.php/)[8]云平臺(tái)對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能分析。結(jié)果表明38個(gè)相關(guān)靶蛋白共參與了962個(gè)GO的生物過程(P<0.01)，涉及到23個(gè)BP(Biological Process，BP)相關(guān)條目、8個(gè)MF(Molecular Function，MF)相關(guān)條目及15個(gè)CC(Cellular Component，CC)相關(guān)條目(圖4)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些靶蛋白在BP中主要參與了“對(duì)內(nèi)外源性刺激的反應(yīng)”“機(jī)體代謝過程”“調(diào)節(jié)生物過程”“細(xì)胞過程及信號(hào)通路”等相關(guān)二級(jí)分類條目。在MF過程中主要參與了“抗氧化活性”“分子功能調(diào)節(jié)”“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性”“離子結(jié)合”“蛋白結(jié)合綁定”“酶催化活性”等主要二級(jí)分類條目。在CC過程中這些蛋白主要參與了“細(xì)胞器”“細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)”“膜封閉腔”“細(xì)胞連接”“突觸”“囊泡”“胞外基質(zhì)”等二級(jí)分類條目。綜合篩選BP+MF+CC三部分中P值最小的前25個(gè)GO功能過程進(jìn)行可視化處理(圖5)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)前25個(gè)功能過程中38個(gè)靶點(diǎn)平均富集程度比率達(dá)55.65%，最高富集比率達(dá)85.7%。

圖4 GO功能二級(jí)分類柱狀圖

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

通過KEGG通路富集篩選、分析共得到相關(guān)通路192條，對(duì)獲得的通路進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)(圖6)，并進(jìn)行注釋和靶點(diǎn)數(shù)目統(tǒng)計(jì)。發(fā)現(xiàn)192條通路涉及5大類A級(jí)通路及其所屬的30類B級(jí)通路。主要涉及到免疫、呼吸、神經(jīng)、內(nèi)分泌四大系統(tǒng)；脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝及與細(xì)胞生長、增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對(duì)KEGG通路富集分析結(jié)果進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)，P≤0.01的通路有7條，主要涉及C-型凝集素受體信號(hào)通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、GnRH信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)和內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路(Endocrine resistance)等。此外還涉及腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、表皮生長因子受體(ErbB)信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路及與炎癥免疫相關(guān)的花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)信號(hào)通路等。推測(cè)唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制可能與干預(yù)以上通路過程有關(guān)。其中，根據(jù)相關(guān)度及P值篩選出前29條信號(hào)通路(圖7)。

縱坐標(biāo)黑色字體表示KEGG A級(jí)通路，彩色字體表示該A級(jí)通路下所屬具體的B級(jí)通路，橫坐標(biāo)表示該通路中富集的基因的數(shù)量

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.1軟件，根據(jù)“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”的對(duì)應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖8)。14個(gè)黃色節(jié)點(diǎn)表示化合物，38個(gè)紅色節(jié)點(diǎn)代表預(yù)測(cè)蛋白靶點(diǎn)，30個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)表示相關(guān)通路。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)關(guān)系既存在一對(duì)多，也存在多對(duì)一，其中化合物山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、對(duì)香豆酸(p-coumaric acid)、咖啡酸(caffeic acid)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin-3-O-gallate]、紅景天苷(salidroside)等化合物具有明顯的多靶點(diǎn)/多通路的作用特征，初步闡釋了唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的活性物質(zhì)及作用機(jī)制。

圖8 化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.討論

紅景天成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，極具開發(fā)潛力。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已表明紅景天具有干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的藥理作用，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制并不完全清楚。

課題組前期對(duì)唐古紅景天干預(yù)低氧性肺動(dòng)脈高壓的活性部位及其抗增殖機(jī)制的研究結(jié)果顯示，其活性部位可以抑制慢性低氧引起的肺動(dòng)脈壓力升高，并通過降低PCNA、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白CDK4的表達(dá)水平抑制p27Kip1降解進(jìn)而抑制PASMCs的增殖，從而發(fā)揮抑制血管重構(gòu)的作用[1]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)唐古紅景天活性部位主要化學(xué)成分干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的可能作用機(jī)制行深入探討。篩選出有效化學(xué)成分14個(gè)、干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的有效靶點(diǎn)38個(gè)。GO功能分析結(jié)果表明，唐古紅景天可能主要通過干擾機(jī)體對(duì)內(nèi)外源性刺激的反應(yīng)、機(jī)體代謝、分子功能調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)合綁定、離子結(jié)合及與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、程序性死亡相關(guān)的具體功能過程而發(fā)揮保護(hù)作用。KEGG通路富集篩選分析結(jié)果顯示，主要涉及“內(nèi)分泌及代謝疾病”“免疫系統(tǒng)”“神經(jīng)系統(tǒng)”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“細(xì)胞的生長和凋亡”“脂質(zhì)代謝”等六大類相關(guān)通路。

其中Liu J等人的研究發(fā)現(xiàn)IL-33可通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1α和VEGF表達(dá)來啟動(dòng)低氧性肺動(dòng)脈高壓的血管重塑[9]；TNF-α在慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓大鼠血管重構(gòu)中發(fā)揮作用，Liu WY等人的研究發(fā)現(xiàn)通過激活NF-κB/TNF-α途徑可以保護(hù)大鼠肺動(dòng)脈高壓[10]；越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明AMPK聯(lián)級(jí)信號(hào)通路在血管動(dòng)態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用，Wang HL等人最新的研究表明AMPKα2敲低可促進(jìn)缺氧條件下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的增殖，這種現(xiàn)象伴有Skp2上調(diào)和p27kip1表達(dá)下調(diào)，并能夠被雷帕霉素(mTOR抑制劑)調(diào)控，即增強(qiáng)對(duì)AMPKα2活性的控制可能是肺動(dòng)脈高壓的新治療策略基礎(chǔ)[11]。此外KEGG分析結(jié)果中所顯示的PI3K-Akt、JAK-STAT、IL-17、FoxO、Ras等多條信號(hào)通路均已證實(shí)與肺動(dòng)脈高壓的形成、發(fā)展及治療有關(guān)[12-16]。

目前已被研究證實(shí)具有干預(yù)肺動(dòng)脈高壓作用的紅景天化學(xué)成分有紅景天苷、槲皮素、異槲皮苷、蘆丁、兒茶素等[17-26]。研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠通過AMPKα1-P53-P27/ P21途徑抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖，并通過AMPKα1-P53-Bax/ Bcl-2-caspase 9-caspase 3途徑逆轉(zhuǎn)凋亡抗性[19]；可通過AKT /GSK3β信號(hào)通路抑制血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的PASMCs增殖[20]；可通過上調(diào)AMPK-mTOR-ULK1途徑的自噬而減輕缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡抗性以及通過影響HIF- 1α進(jìn)而對(duì)肺血管收縮及重建起作用[21-22]。槲皮素能夠呈劑量依賴性方式抑制缺氧低氧下TrkA/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，并能單獨(dú)抑制TrkA/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而減少PASMCs遷移，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡[23]；還能夠通過Akt和Erk1/2途徑抑制肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)轉(zhuǎn)分化從而有效治療肺動(dòng)脈高壓[24]；槲皮素還可通過FOXO1-SENS3-mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的PASMCs自噬[25]。異槲皮苷可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMCs增殖，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4的表達(dá)，并抑制p27Kip1的降解，并對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的PDGF-β、Akt/GSK3β和ERK1/2磷酸化產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用，引起G0/G1期細(xì)胞周期停滯[26]。根據(jù)“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可知，唐古紅景天活性部位中槲皮素、山奈酚、對(duì)香豆酸、咖啡酸、紅景天苷等化合物作用靶點(diǎn)及通路較多，存在單組分-多靶點(diǎn)、多組分-單靶點(diǎn)的特點(diǎn)，部分機(jī)制已被相關(guān)研究所證實(shí)，為深入闡明唐古紅景天干預(yù)肺動(dòng)脈高壓的多組分-多靶點(diǎn)機(jī)制，以及開展各活性成分間相互作用(協(xié)同、疊加、拮抗)研究提供了思路。