張 偉，陳雨露，黃維義，杜延飛，涂 婷，鄭舒展

0 引 言

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病的潛在病理過(guò)程[1]，也是目前導(dǎo)致人類死亡最主要的病因[2-3]。在體內(nèi)當(dāng)氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein， oxLDL)被巨噬細(xì)胞大量攝取時(shí)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增加，形成AS特征性的巨噬源性泡沫細(xì)胞，最終導(dǎo)致AS形成[4]。減少泡沫細(xì)胞形成，抑制AS的進(jìn)展，是現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。

自噬是指細(xì)胞的自我吞噬，在保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。近年來(lái)，大量的研究已將自噬與心血管相關(guān)疾病聯(lián)系起來(lái)，并且發(fā)現(xiàn)自噬功能障礙會(huì)促進(jìn)AS的進(jìn)展，上調(diào)自噬水平可以抑制AS[5-6]。目前研究最多的為PIK3/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用。最新研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)在調(diào)節(jié)自噬減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，抑制AS上同樣起著重要作用[7-8]。 他汀類藥物通過(guò)抑制3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成，長(zhǎng)期以來(lái)被作為AS及高膽固醇血癥治療的常規(guī)藥物，在降低心血管事件發(fā)生率及膽固醇水平上有著良好的效果。有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)可以通過(guò)上調(diào)自噬，抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少脂質(zhì)沉積穩(wěn)定AS斑塊[9-10]。本研究擬探索ATV是否可以通過(guò)影響TFEB從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬，為ATV在分子機(jī)制上治療AS提供新的見(jiàn)解及策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、藥物與試劑人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司，中國(guó))；ATV(北京嘉林藥業(yè)贈(zèng)，中國(guó))；氯喹( MedChemExpress，美國(guó))； oxLDL(廣州奕源，中國(guó))；游離膽固醇/總膽固醇酶法測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，中國(guó))；熒光標(biāo)記膽固醇外流試劑分析盒(BioVison，美國(guó))；一抗：LC3II/I抗體、P62抗體、LAMP 1抗體、TFEB抗體(CST，美國(guó))、GAPDH內(nèi)參抗體(BBI Life Sciences，中國(guó))；二抗：HRP羊抗兔二抗(BBI Life Sciences，中國(guó))；HRP羊抗鼠二抗(BBI Life Sciences，中國(guó))。

1.1.2 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heracell 150i，Thermo scientific，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2G，蘇州凈化，中國(guó))；可調(diào)微量移液器(Eppendorf公司；德國(guó))；超純水儀(Elix3/Mini-Qbicel，Millipore，美國(guó))；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；垂直電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEAN Tetra Cell，Bio-Rad，美國(guó))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Infinite M200，TECAN，瑞士)；凝膠成像系統(tǒng)(Universal-Hood II，Bio-Rad，美國(guó))；熒光顯微鏡(3K85017，Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI-1640(含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素)的培養(yǎng)瓶中，放置于5%CO2,37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4 d加液1次，當(dāng)細(xì)胞密度>80%后進(jìn)行傳代。

1.2.2 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型建立THP-1細(xì)胞離心去上清液后，加入含100 ng/mL 佛波酯的無(wú)血清1640培養(yǎng)基，并將細(xì)胞種于6孔板中，放置于5%CO2,37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。吸凈孔板中的含有佛波酯的培養(yǎng)基， PBS清洗2～3遍，加入含有終濃度為50 mg/L oxLDL的3%胎牛血清培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞。

1.2.3 CCK8法細(xì)胞毒性檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，密度>80%時(shí)，將THP-1細(xì)胞以5000個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加入200 μL含有佛波酯的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。吸出培養(yǎng)基并PBS清洗，加入含有不同濃度梯度及50 mg/L oxLDL的藥物，培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)基，以1∶9配置好CCK8溶液，每孔加入100 μL，培養(yǎng)4 h后于450 nm測(cè)量吸光度值。分為空白孔(不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基)、實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、待測(cè)物質(zhì))、對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、無(wú)待測(cè)物質(zhì))、氯喹(0、1、5、10、25、50)μmol/L、ATV(0、1、5、10、25、50)μmol/L，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)

1.2.4 油紅O染色判斷細(xì)胞內(nèi)脂滴含量經(jīng)上一步實(shí)驗(yàn)確定氯喹及ATV的使用濃度，將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞數(shù)約為1×107/孔，將其誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后，分為空白組(培養(yǎng)基)、oxLDL組、oxLDL+氯喹組、oxLDL + ATV組、oxLDL+氯喹+ATV組。oxLDL、氯喹、ATV濃度分別為50 mg/L、25 μmol/L、10 μmol/L，每組細(xì)胞均先使用藥物預(yù)處理0.5 h后，加入oxLDL培養(yǎng)48 h。用PBS清洗2～3遍，4%多聚甲醛，37 ℃固定15 min，油紅O染色30 min，60%異丙醇漂洗5～10 s，鏡下觀察并拍照。

1.2.5 氧化酶法檢查細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇(FC)、總膽固醇(TC)含量細(xì)胞接種于6孔板中，具體處理方法同上。之后PBS清洗3遍，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，混勻，碾磨10 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中， 2000×g離心，離心半徑10 cm，離心5 min。按照說(shuō)明書(shū)配置工作液以及膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，將190 μL工作液加入96孔板中，并加入10 μL待測(cè)樣品以及配置好的標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃反應(yīng)20 min后，于550 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量孔板的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其濃度，同時(shí)測(cè)量蛋白濃度以校正FC、TC；CE(膽固醇脂)為TC與FC之差。

1.2.6 膽固醇外流率測(cè)定將THP-1細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入約1×105個(gè)細(xì)胞，佛波酯誘導(dǎo)48 h分化為巨噬細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)加入標(biāo)記試劑培養(yǎng)1 h，在加入配置好的緩沖液培養(yǎng)16 h后，使用不含酚紅的1640培養(yǎng)基清洗3遍，各組分別加入藥物處理后，熒光顯微鏡測(cè)量細(xì)胞上清液熒光強(qiáng)度，并裂解細(xì)胞測(cè)量細(xì)胞裂解物熒光強(qiáng)度，全程細(xì)胞處理均需避光，培養(yǎng)基使用不含酚紅的1640培養(yǎng)基；膽固醇流出率計(jì)算公式如下：

膽固醇流出率=上清液熒光強(qiáng)度/(上清液熒光強(qiáng)度+細(xì)胞裂解物的熒光強(qiáng)度)×100%

1.2.7 Western blot法檢測(cè)LC3II/I、P62、LAMP 1、TFEB的蛋白含量各組細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)結(jié)束后，PBS清洗3遍，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，校正蛋白濃度，加入上樣緩沖液后混勻， 100 ℃沸水變性10 min， -20 ℃保存。取20 μg蛋白，SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)模值PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶封閉，加入對(duì)應(yīng)的一抗：LC3II/I、P62、LAMP 1、TFEB(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶8000稀釋)，4 ℃冰箱過(guò)夜，24 h取出并TBST清洗3次，每次約10 min，加入相應(yīng)的二抗室溫下水平脫色搖床孵育2 h，TBST清洗3次，每次約10 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影。以quantity one 圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1巨噬源性泡沫細(xì)胞模型鑒定THP-1細(xì)胞加入含100ng/mL的佛波酯誘導(dǎo)48 h后，鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)或橢圓形并伸出偽足，且貼壁生長(zhǎng)，證明巨噬細(xì)胞已誘導(dǎo)成功，見(jiàn)圖1。加入50 mg/L oxLDL培養(yǎng)48 h后，油紅O染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴存在, CE/TC>50%，證明巨噬源性泡沫細(xì)胞模型建立成功。

a:THP-1細(xì)胞；b：巨噬細(xì)胞

圖1 THP 1細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)48 h后的變化( ×400)

Figure 1 THP 1 cells were transformed into macrophages after 48 h of PMA induction ( ×400)

2.2 確定ATV及氯喹對(duì)細(xì)胞的合適處理劑量當(dāng)氯喹濃度>25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率有所下降，ATV濃度>10 μmol/L，細(xì)胞存活率有所下降(P<0.01)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇氯喹及ATV的濃度分別為25 μmol/L、10 μmol/L。見(jiàn)圖2。

與 0 μmol/L 比較，*P<0.01

圖2 CCK8測(cè)量氯喹及ATV的細(xì)胞毒性

Figure 2 CCK8 measures cytotoxicity of CQ and ATV

2.3 細(xì)胞油紅O染色結(jié)果油紅O染色后光鏡下可見(jiàn)，空白組巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量紅色脂滴；oxLDL組細(xì)胞內(nèi)含有大量紅色脂滴，泡沫細(xì)胞形成；oxLDL+氯喹組細(xì)胞內(nèi)脂滴較oxLDL組、oxLDL+氯喹+ATV組增加，而oxLDL+ATV組細(xì)胞內(nèi)脂滴較oxLDL組降低。見(jiàn)圖3。

2.4 各組細(xì)胞內(nèi)FC、TC、CE/TC含量及細(xì)胞膽固醇外流率比較oxLDL+ATV組、空白組細(xì)胞內(nèi)FC、TC、CE、CE/TC含量較oxLDL組明顯降低(P<0.05)；oxLDL+氯喹+ATV組細(xì)胞內(nèi)FC、TC、CE、CE/TC含量較oxLDL+氯喹組明顯降低(P<0.05)；oxLDL+氯喹組FC、TC、CE、CE/TC含量較oxLDL組明顯升高(P<0.05)。與oxLDL組細(xì)胞膽固醇外流率比較，oxLDL+氯喹組明顯降低(P<0.05)，空白組、oxLDL+ATV組明顯升高(P<0.05)；與oxLDL+氯喹組細(xì)胞膽固醇外流率比較，oxLDL+氯喹+ATV組明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5 泡沫細(xì)胞LC3II/I、P62、LAMP 1、TFEB蛋白的表達(dá)與oxLDL組比較，oxLDL+氯喹組、空白組LC3II/I、P62、TFEB蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，oxLDL+氯喹組LAMP1蛋白表達(dá)亦升高(P<0.05);oxLDL+ ATV組細(xì)胞LC3II/I、TFEB、LAMP1水平明顯升高，P62水平明顯降低(P<0.05)。與oxLDL+氯喹組比較，oxLDL+氯喹+ ATV組LC3II/I、P62蛋白表達(dá)水平明顯降低，TFEB、LAMP1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表2。

a:空白組；b: oxLDL組；c:oxLDL+氯喹組；d:oxLDL+ATV組；e:oxLDL+氯喹+ ATV組

圖示oxLDL+氯喹組細(xì)胞內(nèi)脂滴較oxLDL組、oxLDL+氯喹+ATV組增加，而oxLDL+ATV組較oxLDL組降低

圖3 油紅O染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴含量變化( ×200)

Figure 3 Oil red O staining was used to observe the changes of red dye lipid droplets in each group ( ×200)

組別FC(μmol/mg)TC(μmol/mg)CE(μmol/mg)CE/TC膽固醇外流率(%)空白組0.044±0.0040.067±0.0070.023±0.0030.343±0.00915.724±1.078oxLDL組0.056±0.013*0.118±0.006*0.062±0.006*0.526±0.019*12.380±1.190*oxLDL+氯喹組0.076±0.004#0.179±0.005#0.103±0.008#0.576±0.032#9.554±1.387#oxLDL+ATV組0.049±0.002#0.092±0.006#0.043±0.004#0.467±0.013#18.592±1.009#oxLDL+氯喹+ATV組0.063±0.006△0.124±0.009△0.056±0.007△0.496±0.039△14.574±2.017△

與空白組比較，*P<0.05；與oxLDL組比較，#P<0.05；與oxLDL+氯喹組比較，△P<0.05

1:空白組；2：oxLDL組；3：oxLDL+氯喹組；4:oxLDL+ATV組；5：oxLDL+氯喹+ATV組

圖4 各組泡沫細(xì)胞LC3II/I、P62、TFEB、LAMP 1蛋白表達(dá)量

Figure 4 Protein expression levels of LC3II/I, P62, TFEB, and LAMP 1 in each group

組別 LC3II/IP62 TFEB LAMP1空白組1.157±0.0440.242±0.0090.392±0.0100.821±0.029oxLDL組1.006±0.052*0.183±0.013* 0.333±0.020*0.835±0.022 oxLDL+氯喹組1.594±0.017#0.257±0.006#0.477±0.024#0.957±0.026#oxLDL+ATV組1.146±0.060#0.115±0.009#0.540±0.031#1.027±0.054#oxLDL+氯喹+ATV組 1.419±0.036△ 0.165±0.006△0.593±0.016△ 1.060±0.046△

與空白組比較，*P<0.05；與oxLDL組比較，#P<0.05；與oxLDL+氯喹組比較，△P<0.05

3 討 論

AS是一種慢性的血管炎癥疾病，涉及許多循環(huán)免疫細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板等[11-12]，尤其是單核細(xì)胞及其誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞在這當(dāng)中起著至關(guān)重要的作用[13]，過(guò)度的脂質(zhì)沉積致使巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇脂堆積，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，并且膽固醇的攝取及外流在泡沫細(xì)胞的形成過(guò)程也中發(fā)揮著重要作用[14-15]。本研究中THP-1細(xì)胞使用佛波酯誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，加入oxLDL處理48h后油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量紅色脂滴，膽固醇外流率明顯降低，CE/TC>50%，證明泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

自噬是一個(gè)高度進(jìn)化保守的過(guò)程，是將細(xì)胞質(zhì)成分運(yùn)送到溶酶體中降解，在延長(zhǎng)細(xì)胞壽命以及集聚脂質(zhì)的降解和循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16-17]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)及P62/SQSTM1為自噬研究的重要蛋白，其中LC3是哺乳動(dòng)物自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白，LC3通過(guò)自噬相關(guān)基因(autophagy related genes，ATG)裂解暴露甘氨酸殘基生成LC3I，在復(fù)合物ATG5-ATG12-ATG16(L)的作用下，最終轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3II，檢測(cè)LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化的水平(LC3II/I)可反映自噬水平[18-20]。P62也稱為SQSTM1，可與LC3泛素化的底物連接，整合到自噬體中，轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬溶酶體中被降解[21]。而進(jìn)一步對(duì)自噬研究發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體的功能狀態(tài)在減少AS的形成上有著至關(guān)重要的作用[7-8]。目前研究證實(shí)了TFEB是現(xiàn)階段唯一已知的驅(qū)動(dòng)自噬基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)TFEB可以增加自噬與自噬溶酶體生發(fā)逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞的自噬功能障礙，是抑制AS的重要過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)TFEB驅(qū)動(dòng)的AS保護(hù)受LC3和P62依賴[7,22-24]。因此，本研究同時(shí)觀察TFEB、LC3、P62以及自噬溶酶體的變化是研究AS所需。

ATV是目前臨床上使用最廣泛且研究最多的他汀類藥物，在防治AS、穩(wěn)定斑塊等方面有著不可替代的作用。本研究采用oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，既往研究認(rèn)為oxLDL對(duì)自噬的影響存在爭(zhēng)議，但本研究發(fā)現(xiàn)oxLDL使自噬相關(guān)蛋白LC3II/I、P62及TFEB均為下降，認(rèn)為oxLDL做為一種自噬抑制劑在發(fā)揮作用，致使細(xì)胞內(nèi)脂滴及膽固醇含量升高、膽固醇外流率降低，泡沫細(xì)胞形成。本研究在加入ATV后，實(shí)驗(yàn)組LC3II/I增強(qiáng)，P62減弱，這表明ATV增強(qiáng)了泡沫細(xì)胞自噬，致使泡沫細(xì)胞膽固醇外流有所增加，細(xì)胞內(nèi)膽固醇及脂滴含量減少，泡沫細(xì)胞的數(shù)量減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)ATV可增強(qiáng)TFEB及溶酶體相關(guān)膜蛋白1的表達(dá)，增強(qiáng)自噬溶酶體表達(dá)。

本研究為了進(jìn)一步確定ATV可通過(guò)影響自噬來(lái)減少泡沫細(xì)胞形成，在實(shí)驗(yàn)中使用氯喹[25]來(lái)抑制自噬，在加入氯喹后，oxLDL+氯喹組LC3II/I及P62蛋白表達(dá)較oxLDL組明顯升高，表明自噬受到抑制，加入ATV共同孵育后，我們觀察到自噬相關(guān)蛋白LC3II/I及P62的表達(dá)有所降低，這表明ATV削弱了氯喹對(duì)泡沫細(xì)胞的自噬抑制作用，泡沫細(xì)胞受損的自噬功能得以修復(fù)，細(xì)胞內(nèi)脂滴及膽固醇含量降低，膽固醇外流率增加，泡沫細(xì)胞形成減少。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)氯喹可以明顯促進(jìn)TFEB的表達(dá)，這是因?yàn)門FEB的表達(dá)受溶酶體功能及PH值的影響[26-27]，這也提示我們TFEB的調(diào)控及自噬是復(fù)雜的，且自噬是一個(gè)變化的過(guò)程，動(dòng)態(tài)的觀察TFEB、自噬及自噬溶酶體的表達(dá)及功能狀態(tài)是必要的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)自噬的下調(diào)可使巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，泡沫細(xì)胞大量形成，而ATV可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自噬及自噬溶酶體表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴及膽固醇含量，增加膽固醇外流，抑制泡沫細(xì)胞形成，其機(jī)制可能與ATV影響TFEB相關(guān)。本研究為ATV的分子機(jī)制及其在AS治療中的新作用提供新見(jiàn)解，同時(shí)利用自噬治療AS，可能是AS治療的一個(gè)發(fā)展策略，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。