李文庭，肖 琿, 楊 亮，音 銘，劉 齊

0 引 言

肝纖維化是肝對各種損傷因素的修復應答。這些損傷因素包括肝炎病毒、酒精、藥物、免疫復合物、代謝物(脂肪)等。肝纖維化的特征是細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的大量產生超過降解，從而沉積在肝導致肝結構和功能的改變。目前公認，肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSCs)是ECM的主要效應細胞，其活化是肝纖維化的關鍵因素。因此，抑制HSCs的活化可以延緩或逆轉肝纖維化[1]。在促進肝纖維化進展的各種信號通路和細胞因子中，轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)被認為是最重要的細胞因子[2]。在肝損傷過程中，肝實質細胞釋放TGF-β1，后者刺激HSCs活化，產生大量的膠原纖維，啟動肝纖維化進程。經典的TGF-β1通路主要是通過Smads實現, 但是隨著研究的深入，學者們發(fā)表越來越多的細胞因子在TGF-β1/Smads通路中發(fā)揮重要作用, 如Nur 77[3-4]。但是對于Nur 77在肝纖維化中的作用罕見報道。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球性的健康問題，全世界仍有將近4億攜帶者[5]。慢性HBV感染易啟動肝纖維化進展并發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。關于HBV相關肝纖維化的機制研究較少。本研究擬探討TGF-β1/Nur 77信號通路在乙肝肝纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料0.4 μmol/L Transwells 購自美國Costar公司，實驗用胎牛血清購于Gibco公司(美國), 含糖DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司(美國), 質粒抽提試劑盒、RNA及DNA抽提試劑盒均購自Qiagen公司(美國)。RT試劑盒(高效cDNA逆轉錄試劑盒) 購自Applied Biosystems公司(美國)。pCMV6-NTCP，Nur77 gRNA及對照質粒(neo)均購于Origene公司(美國，RC210241)。鼠抗α-SMA購于Abcam公司(ab5694)，兔抗Col1A1購于Thermo Fisher Scientific公司(MAI-141)，兔抗TIMP-1購于Cell signaling公司 (D10E6)，兔抗NTCP 購于SANTA CRUZ公司(sc-98484，美國), 兔抗Nur 77抗體分別購于美國和中國(NB100-56745, Novus,美國; BS3260, 巴傲德,南京), 鼠抗β-actin購于Abcam公司(ab8227)，二抗購于GE Healthcare公司(英國)。實驗中所用的Huh 7.5.1細胞，HepAD38細胞及人肝星狀細胞LX-2細胞均由本實驗室保存。重組人TGF-β1蛋白購自R&D System公司(240-B/CF)。

1.2方法

1.2.1 組織標本來源選取在中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院) 感染病院的8例住院慢性乙型肝炎患者的肝組織標本。納入標準：既往未接受過抗病毒治療；診斷標準符合慢性乙肝防治指南[6]。排除標準：合并其他嗜肝病毒感染，如丙肝病毒、戊肝病毒及艾滋病毒等；腫瘤；合并其他器官嚴重損害。入組患者行生化、HBV DNA 定量、HBV血清學及病毒學檢查，肝穿刺術。所取肝組織行進一步病理檢查。

1.2.2組織病理學及免疫組化使用巴德活檢槍針(18 G, 910 cm，美國)，通過肝穿刺采集患者肝組織。將患者肝組織固定于10%甲醇中，石蠟包埋切片。行HE和Masson′S染色?；颊吒卫w維化分期采用Metavir標準：S0:無纖維化; S1:少量纖維；S2:纖維組織向小葉外延伸；S3:橋形纖維化；S4:假小葉形成，肝硬化[7]。同時，將組織切片用內源性過氧化物酶和牛血清白蛋白封閉后，使用Nur77抗體4 ℃孵育過夜，次日，將切片用PBS洗凈，在37 ℃下復溫30 min；然后將切片與HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋至1∶200)在37 ℃中孵育30 min[8]，PBS洗凈后蘇木精復染，最后將切片再次洗凈，顯微鏡下觀察。

1.2.3細胞培養(yǎng)與病毒制備Huh 7.5.1、 Hep AD38及LX-2 細胞均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度設為37 ℃，CO2的濃度為5%(v/v)。本研究使用的乙肝病毒來源于Hep AD38 細胞上清液。Hep AD38 常規(guī)培養(yǎng)時加G418, 終濃度為200 μg/mL。收集病毒時，停用G418，培養(yǎng)3 d后收集上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4質粒的抽提與轉染pCMV6-NTCP、Nur 77 gRNA及對照質粒(neo)的抽提使用質粒抽提試劑盒(Qiagen公司)，操作步驟按照說明書進行，實驗結束，測質粒濃度，雙蒸水稀釋至1 μg/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。pCMV6-NTCP、Nur 77 gRNA及對照質粒(neo)的轉染使用Lipofectamine LTX reagent(Life Technologies, USA)。先將1 μg質粒(pCMV6-NTCP、Nur 77 gRNA及neo)與0.5 μL PLUSTMReagent混勻，溶于培養(yǎng)基中，靜置5 min；同時，將LTX Reagent 2 μL溶于培養(yǎng)基中，靜置5 min；然后將兩者混勻，加入到細胞中。比例如下：質粒(μg)∶PLUSTMReagent (μL)∶LTX Reagent (μL)=1∶0.5∶2, 具體操作見說明書。細胞轉染質粒如下：NTCP-Huh 7.5.1細胞(轉染pCMV6-NTCP的Huh 7.5.1細胞)，LX-2-neo (LX-2轉染對照質粒neo)，LX-2-Nur77gRNA(LX-2轉染Nur77gRNA)。

1.2.5NTCP-Huh7.5.1細胞的鑒定及HBV感染模型的建立將Huh 7.5.1按照5×104細胞/mL接種于12孔版，24 h后轉染pCMV6-NTCP，72 h后收集細胞蛋白，檢測NTCP蛋白的表達。將收集的HBV病毒液加入NTCP-Huh 7.5.1細胞中，72 h后，收集細胞上清液總的DNA及細胞RNA。

1.2.6TGF-β1刺激LX-2細胞將LX-2細胞按照5×104細胞/mL接種于12孔版，24 h后換液，加用TGF-β1刺激72 h (終濃度為10 ng/mL)。換液后再分別轉染Nur77gRNA及對照質粒 (neo)，24 h后換液，加用TGF-β1刺激72 h (終濃度為10 ng/mL)。分為LX-2-neo組(LX-2轉染neo)、LX-2-neo+TGF-β1組(LX-2轉染neo后TGF-β1刺激)、LX-2-Nur 77 gRNA+TGF-β1組(LX-2轉染Nur 77 gRNA后TGF-β1刺激)。實驗結束后收集各組細胞RNA及蛋白質，檢測細胞Nur 77、α-SMA、TIMP-1及CoL1A1 mRNA及蛋白表達。

1.2.7細胞共培養(yǎng)體系的建立NTCP-Huh 7.5.1與LX-2 細胞共培養(yǎng)采用Transwell系統。將HBV感染的NTCP-Huh 7.5.1細胞按照2×104細胞/1 mL接種于Transwell的下室，將轉染NR4A1 gRNA后的LX-2 細胞按照1×104細胞/0.5 mL接種于Transwell的上室，孵育72 h后，收集細胞進行RNA及蛋白質提取。根據轉染方式不同分為：LX-2-neo組(LX-2轉染對照質粒)、LX-2-neo+ HBV組(LX-2轉染對照質粒與HBV感染的NTCP-Huh 7.5.1細胞共培養(yǎng))、LX-2-Nur77gRNA+ HBV組(LX-2轉染Nur 77 gRNA與HBV感染的NTCP-Huh 7.5.1細胞共培養(yǎng))。

1.2.8逆轉錄PCR(RT-PCR)及定量PCR(qPCR)細胞RNA的提取使用RNA抽提試劑盒(Qiagen公司, 美國)，具體操作步驟參照說明書。RT按照說明書操作進行。qPCR在ABI QuantStudio?3 system (Applied Biosystems Inc)中完成。使用SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)標記。通過△△Ct與作為內部對照的GAPDH進行比較，測算目標基因表達 相對量。引物序列如下：α-SMA，F(5′-3′)AAAAGACAGCTACGTGGGTGA，R(5′-3′)GCCATGTTCTATCGGGTACTTC；TIMP-1，F(5′-3′) ACTTCCACAGGTCCCACAAC，R(5′-3′) GCTAAGCTCAGGCTGTTCCA；Col1A1，F(5′-3′) CAGCCGCTTCACCTACAGC，R(5′-3′) TCAATCACTGTCTTGCCCCA；TGF-β1，F(5′-3′) CTCTCCGACCTGCCACAGA，R(5′-3′) AACCTAGATGGGCGCGATCT；NR4A1，F(5′-3′) GGCATGGTGAAGGAAGTTGT，R(5′-3′)CAGGGAAGTGAGGAGATTGG；HBV，F(5′-3′)GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA, R(5′-3′)CACCTCTGCCTAATCATC;GAPDH, F(5′-3′) TCACCACCATGGAGAAGGC, R(5′-3′) GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA。

1.2.9Western-blot細胞蛋白質的提取使用試劑盒。提取的蛋白質通過在10%SDSPAGE凝膠上運行，并在聚偏氟乙烯膜(PVDF)上電轉移。用5%牛血清清蛋白孵育后，用一抗在4 ℃孵育過夜。用TBST溶液(Tris 10 mm，NaCl 150 mm，Tween-20 0.05%(v/v))洗滌后，用HRP標記的山羊抗兔二級抗體孵育1 h。然后用TBST再次清洗斑點，然后用ECL染色。通過與β-actin條帶的比較，對相關表達進行定量。

2 結 果

2.1肝纖維化分期及免疫組織化學染色檢測肝組織Nur77表達S1期肝組織可見大致正常肝組織及少量纖維形成。S2期肝組織可見肝小葉結構破壞，纖維組織向小業(yè)內延伸； S3期肝組織結構紊亂，可見橋形纖維化； S4期肝組織可見肝小葉結構破壞和假小葉形成。見圖1。免疫組化結果顯示，隨著纖維化分級的增加，肝組織Nur77表達增強。見圖1。

a-d：肝結構(HE ×100)；e-h：膠原(Masson ×100); i-l：肝組織Nur 77的表達(免疫組化染色 ×200)

圖示隨著肝纖維化分期的增加，肝組織Nur77表達增強

圖 1 肝組織學變化及免疫組織化學染色檢測不同分期肝組織Nur77的表達

Figure 1 Liver pathologyand Nur 77 expressionin liver tissue with different fibrosis score

2.2NTCP-Huh 7.5.1 細胞的構建以及HBV感染測定Western blot檢測顯示，正常Huh 7.5.1細胞不表達NTCP，轉染pCMV6-NTCP后，Huh7.5.1 細胞高表達NTCP，見圖2。

qPCR結果顯示，HBV感染后72 h，NTCP-Huh 7.5.1上清中HBV DNA水平(×103copies/mL)明顯升高[(5.39±0.96)vs(0.00±0.00)，P<0.05]，同時細胞中TGF-β1mRNA水平明顯升高[(1.94±0.37)vs(1.00±0.00)，P<0.05]。

2.3TGF-β1/Nur77 信號通路對LX-2活化的影響qPCR結果顯示，TGF-β1刺激LX-2 細胞72h后， Nur 77，α-SMA, TIMP-1及CoL1A1mRNA表達明顯高于無TGF-β1刺激的LX-2細胞(P<0.05)。見表1。此外，與LX-2-neo組Nur 77、 α-SMA、TIMP-1、CoL1A1表達比較，LX-2-neo+ TGF-β1組明顯升高(P<0.01)。LX-2-Nur 77 gRNA+ TGF-β1組Nur 77、α-SMA、TIMP-1、CoL1A1表達較LX-2-neo+ TGF-β1組明顯降低(P<0.01)。見表2。Western-blot結果表明，敲除LX-2細胞Nur 77后，TGF-β1刺激無法增強LX-2細胞α-SMA,、TIMP-1及CoL1A1 mRNA和蛋白表達。見圖3。

1：Huh 7.5.1； 2：NTCP-Huh 7.5.1

圖 2 Western-blot 檢測NTCP 表達

Figure 2 Expression of NTCP in Huh 7.5.1 and NTCP-Huh 7.5.1 cells by Western-blot

細胞處理Nur 77α-SMATIMP-1CoL1A1LX-2100.00±18.15100.00±5.74100.00±8.52100.00±17.92LX-2+TGF-β1227.14±12.16*213.97±7.86**213.82±23.30*358.34±31.08**

與LX-2比較，*P<0.01、**P<0.001

圖 3 Western-blot檢測LX-2 細胞蛋白表達

Figure 3 Protein expression in LX-2 cells by Western-blot

2.4敲除LX-2細胞的Nur 77對HBV活化LX-2的影響qPCR表明，與LX-2-對照質粒組 Nur 77、α-SMA、 TIMP-1及CoL1A1表達比較，LX-2-neo+ HBV組均明顯升高(P<0.01)；與LX-2-neo+ HBV組Nur 77、α-SMA、TIMP-1及CoL1A1表達比較，LX-2-Nur77gRNA+ HBV組明顯降低(P<0.01)。見表2。Western-blot結果表明，敲除LX-2細胞的Nur 77后，與HBV感染的NTCP-Huh 7.5.1共培養(yǎng)無法增強LX-2細胞Nur 77、α-SMA、TIMP-1及CoL1A1蛋白表達。見圖4。

圖 4 Western-blot檢測LX-2 細胞蛋白表達

Figure 4 Protein expression in LX-2 cells by Western-blot

組別Nur 77α-SMATIMP-1CoL1A1LX-2-neo組100.00±27.27100.00+10.81100.00±8.55100.00±22.31LX-2-neo+ TGF-β1組204.63±38.24**227.72±13.23*216.00±13.20**330.07±71.63**LX-2-Nur 77 gRNA+ TGF-β1組44.77±5.94*##102.93±15.12#110.15±6.22##110.29±14.84##LX-2-對照質粒組100.00±26.14100.00±22.18100.00±3.55100.00±2.76LX-2-neo+ HBV組199.10±12.84▲▲205.60±49.53▲213.16±14.93▲▲271.77±31.05▲▲LX-2-Nur77gRNA+ HBV組42.07±3.53▲☆96.63±15.20☆☆95.58±11.27☆108.97±12.41☆

與LX-2-neo組比較，*P<0.01、**P<0.001;與LX-2-neo+TGF-β1組比較，#P<0.01、##P<0.001; 與LX-2-對照質粒組比較，▲P<0.01、▲▲P<0.001;與LX-2-neo+ HBV組比較，☆P<0.01、☆☆P<0.001

3 討 論

肝纖維化是肝對慢性損傷的愈合反應。在我國，慢性仍是肝纖維化的主要誘因。盡管疫苗的廣泛接種顯著降低了HBV的感染率，慢性HBV感染仍不可避免地會發(fā)展為肝纖維化甚至肝硬化。大量研究證實，TGF-β1對星狀細胞的活化是肝纖維化的核心。隨著研究的深入，發(fā)現，眾多因子在TGF-β1信號的信號傳導中發(fā)揮重要作用[4,9], 如Nur 77。 Nur 77，又被稱為 TR3, NR4A1或者NGF-IB，屬于類固醇激素受體超家族[10]。Nur 77參與了一系列生物學進程，包括糖及脂肪代謝，細胞凋亡，血管內平衡及纖維化等[4, 11-12]。因此，本研究探索了TGF-β1/Nur 77在HBV誘導的星狀細胞活化中的作用，為乙肝肝纖維化的治療提供新的靶點。

本研究初步觀察了8例在我院行肝穿的慢乙肝初治患者，評估了肝纖維化程度與Nur77 表達的關系，發(fā)現Nur77在肝臟的表達隨著肝纖維化程度的增加而增強，提示Nur 77在乙肝肝纖維化進程中可能發(fā)揮一定的作用。為了深入研究HBV及其相關疾病，科學家們建立了多種細胞模型，如Hep AD38, 這是一種通過基因手段改造后的細胞，可分泌D型HBV，其缺點是不能模擬HBV的自然感染過程。鈉離子?；悄懰峁厕D運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是HBV的功能性受體，HBV可借此感染肝細胞[13]?？茖W工作者也嘗試在肝細胞中過表達NTCP以建立HBV體外感染模型，并取得了豐碩的成果[14]。本研究顯示，感染72小時，NTCP- Huh 7.5.1上清中 HBV DNA水平為5.39±0.96×103copies/ml，明顯高于對照 (P<0.01)，說明NTCP-Huh 7.5.1細胞能支持HBV復制，這與課題組前期結果相符[15]。qPCR結果顯示，HBV 感染后的NTCP-Huh 7.5.1高表達TGF-β1，明顯高于正常培養(yǎng)的NTCP-Huh 7.5.1(P<0.01)，而TGF-β1被認為是肝纖維化的重要促進因子[16]。

本研究使用TGF-β1刺激人肝星狀細胞(LX-2)后，LX-2細胞高表達Nur 77，同時，肝纖維化指標α-SMA, TIMP-1及CoL1A1 mRNA表達明顯升高。使用gRNA敲除LX-2細胞Nur 77后，即使再使用TGF-β1刺激，肝纖維化指標仍無明顯升高，這說明TGF-β1通過Nur 77啟動肝纖維化進程。

為深入探索細胞間相互作用在肝纖維化進程中的作用，學者們開發(fā)出了細胞共培養(yǎng)系統。在這個系統中，可以將肝細胞與肝星狀細胞共培養(yǎng)，兩種細胞由0.4um的膜隔開，但可以發(fā)生物質交換和信號傳導[17]。本研究結果顯示, 與感染HBV的Huh 7.5.1細胞共培養(yǎng)后, LX-2細胞明顯活化, α-SMA, TIMP-1及CoL1A1 mRNA表達明顯升高, 敲除LX-2細胞Nur77后, 肝纖維化指標表達明顯下降, 說明HBV啟動TGF-β1/ Nur77信號通路促進肝纖維化進展。

綜上所述，本文從細胞水平以及組織學兩個層面初步證實了HBV感染可能對TGF-β1/ Nur77信號通路的促進作用，并通過活化肝星狀細胞促進肝纖維化進展。但仍需要擴大樣本量并進行動物實驗進一步明確TGF-β1/ Nur77信號通路在乙肝肝纖維化中的作用及機制，以期為將來為乙肝肝纖維化的藥物開發(fā)提供理論依據。