(四川省人民醫(yī)院東院乳腺甲狀腺外科，四川 成都 610000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有上升趨勢[1]。盡管乳腺癌的篩查和治療取得了一定進展，但仍然是女性因癌癥死亡的主要疾病之一。目前的研究表明，乳腺癌的發(fā)生與遺傳因素、免疫失調、激素紊亂有關，其發(fā)生、發(fā)展與多種抑癌基因與促癌因子比例失調密切相關，但其主要的發(fā)病機制尚不清楚[2]，因此闡明乳腺癌發(fā)病機理及其相關分子機制，尋找新的治療策略尤為重要。

microRNA(miR)是一類長度為18～24 nt的非編碼短鏈RNA，不直接編碼蛋白，而是通過調控目的基因的表達，從而影響細胞的增殖、遷移及侵襲[3]。miR-200b(miRBase ID：MIMAT0000318)是miR-200家族成員之一，在多種內皮細胞、干細胞和癌細胞中有表達，并廣泛調節(jié)細胞的生物學行為[4-5]。miR-200b家族在上皮間質轉化中發(fā)揮重要作用，可抑制癌細胞增殖和遷移[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b在結腸癌、胃癌、乳腺癌中的表達均有降低，但具體機制尚未闡明[7-9]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor4,PDCD4)是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因之一，與miR-200b在胃癌中的表達呈負相關，抑制胃癌細胞miR-21的表達后可上調表達，發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡的作用，且PDCD4的下調與雌激素受體陽性乳腺癌預后不良相關[10-11]。然而，miR-200b與PDCD4在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中是否起到關鍵作用尚不清楚，因此，本研究測定miR-200b在乳腺癌組織和細胞株中的表達水平，并通過生物信息學預測PDCD4和miR-200b結合序列的相似關系，進一步研究miR-200b和PDCD4在乳腺癌細胞株中的調控關系及其對乳腺癌細胞株生物學行為的影響，為闡明乳腺癌的發(fā)病機制提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 臨床標本采集與處理

收集2017年6月至2018年2月在我院經病理檢查確診為乳腺癌的患者標本(腫瘤組織及癌旁組織43例)。離體后迅速放入液氮罐中低溫保存。所有患者術前未行化療、放療、基因靶向治療，乳腺癌為原發(fā)病灶并經病理科證實。本研究通過我院倫理委員會審批，術前患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 細胞株與主要試劑

人乳腺癌細胞HCC38、MCF-7、MDA-MB-231及人乳腺正常上皮細胞MCF10A均購于美國ATCC公司，1640培養(yǎng)液、特級胎牛血清、雙抗溶液及OPTI-ME購于美國Gibco公司。PDCD4兔抗、GAPDH兔抗、二抗山羊抗兔均購于美國Santa Cruz公司。miR-200b qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購于上海吉瑪基因有限公司。Lipo2000試劑購于美國Invitrogen公司?；|膠(Matrige1)購于美國BD公司。Transwell小室購于美國Costar公司。miR-200b-siRNA、PDCD4-mimics及對照miRNA購自上海吉凱制藥技術有限公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、高靈敏ECL化學放光試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉染分組 將HCC38、MCF-7、MDA-MB-231、MCF10A細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件：溫度37 ℃，5%CO2。轉染前24 h，將細胞以50%～60%的密度接種于生長培養(yǎng)基中。根據培養(yǎng)手冊，使用Lipofectamine RNAiMax將miR-200b siRNA轉染MCF-7細胞，獲得穩(wěn)定轉染細胞后將PDCD4 mimics轉染到已轉染miR-200b siRNA的MCF-7細胞中。將細胞分為4組，轉染miR-200b siRNA的MCF-7細胞為miR-200b實驗組，未轉染的MCF-7細胞為miR-200b對照組，同時轉染miR-200b和PDCD4蛋白的MCF-7細胞為PDCD4實驗組，只轉染miR-200b的MCF-7細胞為PDCD4對照組。

1.3.2 RNA提取和熒光實時定量PCR檢測miR-200b的表達 Trozel法提取組織及細胞內總RNA，逆轉錄，PCR擴增miR-200b，使用GAPDH作為內參。反應條件：以100 ng總RNA為模板，逆轉錄cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min。然后根據PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。miR-200b上游引物：5′-TGCCGTAATACTGCCTGGTAA-3′；下游引物：5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′。GAPDH內參上游引物：5′-GGTCGGGCAGGAAAGAGGGC-3′；下游引物：5′-CTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3′。PDCD4上游引物：5′-AAGAAAGGTGGTGCAGGAGG-3′；下游引物：5′-TGACTAGCCTTCCCCTCCAA-3′。

1.3.3 雙熒光素酶活性測定 miR-200b和PDCD4重組質粒共轉染到MCF-7細胞中。分組如下：miR-200b siRNA+Wt PDCD4、miR-200b NC+Wt PDCD4、miR-200b siRNA+Mut PDCD4、miR-200b NC+Mut PDCD4。根據siPORTneoFX使用方法操作，在轉染后48 h 制備裂解物。然后根據說明書，使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)進行熒光素酶分析。實驗重復3次。

1.3.4 蛋白免疫印跡實驗檢測PDCD4的表達水平 提取蛋白后，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離等量的蛋白質。將凝膠上的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，然后在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。PDCD4一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育溫育過夜后，用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，最后使用ECL顯影液檢測目標蛋白的表達水平。使用GAPDH作為蛋白對照。實驗重復3次。

1.3.5 CCK-8實驗測定細胞增殖活性 使用CCK-8試劑盒測定細胞的活性。將經過轉染的MCF-7細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后加入20 μL的CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶標儀板在490 nm波長下測量不同組的OD值。實驗重復3次。

1.3.6 Transwell侵襲實驗 將基質膠在4 ℃環(huán)境中過夜融化，與3倍體積的無血清培養(yǎng)基混合均勻后加入24孔Transwell小室(每孔50 μL)。復溫30 min后，將250 mL 10%FBS、1640加入下室中，并且將1×105個細胞種植在上室中，在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng) 24 h。利用棉簽輕微地清潔膜上表面的細胞，穿透聚碳酸酯膜的細胞用甲醇固定并用0.1%結晶紫染色。隨機選擇5個視野，在倒置顯微鏡下計數侵襲到下側的細胞數。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 人乳腺癌組織及不同乳腺癌細胞株中miR-200b表達水平的比較

實時定量PCR結果顯示，miR-200b在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1a。HCC38、MCF-7、MDA-MB-231細胞株中miR-200b的表達水平高于正常乳腺上皮細胞MCF10A，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1b；MCF-7細胞株相對于HCC38和MDA-MB-231細胞株中miR-200b的表達水平較高，因此后續(xù)實驗選取乳腺癌MCF-7細胞株作為研究對象。

a：miR-200b在不同組織中的表達水平 *：與正常組織比較，P<0.05; b:miR-200b在不同細胞株中的表達水平 *：與MCF10A比較，P<0.05

圖1 人乳腺癌組織及不同乳腺癌細胞株中miR-200b表達水平的比較

2.2 miR-200b和PDCD4在乳腺癌細胞株MCF-7中的調控關系

采用TargetScan、PicTar4和miRanda數據庫對miR-200b進行檢索，預測其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-200b和PDCD4間有部分相同的結合序列(圖2a)。因此通過雙熒光素酶報告基因明確miR-200b和PDCD4間的調控關系。將miR-200b siRNA、PDCD4 3′-UTR共轉染到MCF-7細胞中，雙熒光素酶報告基因結果顯示：與miR-200b NC+Mut PDCD4相比，miR-200b siRNA+Mut PDCD4的熒光素酶活性顯著增高;抑制miR-200b的表達后，PDCD4的表達及活性相應上調[(1.51±0.33)vs.(1.22±0.15)，P<0.001]，見圖2b。

a:miR-200b和PDCD4間有部分相同的結合序列;b:雙熒光素酶報告基因明確miR-200b和PDCD4間的調控關系 *：與miR-200b siRNA Mut PDCD4比較，P<0.001

圖2 miR-200b和PDCD4在乳腺癌細胞株MCF-7中的調控關系

2.3 miR-200b對MCF-7細胞株PDCD4蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力的影響

蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-200b表達后，PDCD4蛋白表達含量下降(P<0.05)，見圖3a；并且抑制miR-200b表達后，與miR-200b siRNA+Wt PDCD4組相比，miR-200b NC+Wt PDCD4組的MCF-7細胞增殖率增高[(0.66±0.19)vs.(0.92±0.25)，P<0.05]，見圖3b。細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)36 h后，miR-200b siRNA+Wt PDCD4和miR-200b NC+Wt PDCD4侵襲至Transwell小室下的MCF-7乳腺癌細胞分別為(245.71±21.04)個和(449.39±39.17)個，表明抑制miR-200b表達后，乳腺癌MCF-7細胞株細胞侵襲能力增強(P<0.05)，見圖3c。

2.4 PDCD4對乳腺癌細胞株PDCD4蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力的影響

蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，增強PDCD4表達后，PDCD4蛋白表達含量上調(P<0.05)，圖4a；增強PDCD4表達后，與miR-200b NC+Mut PDCD4組相比，miR-200b siRNA+Mut PDCD4組MCF-7細胞增殖率降低[(0.63±0.15)vs.(0.34±0.09)，P<0.05]，見圖4b。細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)36 h后，miR-200b siRNA+Mut PDCD4和miR-200b NC+Mut PDCD4侵襲至Transwell小室下的MCF-7乳腺癌細胞分別為(265.71±18.21)個和(142.33±16.29)個，表明增強PDCD4表達后，乳腺癌MCF-7細胞株細胞侵襲能力減弱，見圖4c。

a:miR-200b對PDCD4蛋白表達的影響;b:miR-200b對細胞活性的影響;c:miR-200b對細胞侵襲能力的影響 *：與miR-200b NC+Wt PDCD4比較，P<0.05

圖3 miR-200b對MCF-7細胞株PDCD4蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力的影響

a:PDCD4蛋白表達的變化;b:PDCD4對細胞活性的影響;c:PDCD4對細胞侵襲能力的影響 *：與miR-200b siRNA+Mut PDCD4比較，P<0.05

圖4 PDCD4對乳腺癌細胞株PDCD4蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力的影響

3 討論

乳腺癌在女性癌癥中發(fā)病率居首位，居高不下的發(fā)病率以及腫瘤的復發(fā)和轉移仍是目前關注的重點，雖然已有大量的學者對其發(fā)病機制進行研究，但尚無統(tǒng)一的定論[12]。目前研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，通過與靶基因的3′-UTR結合，形成RNA誘導或沉默復合體，在轉錄或翻譯水平對靶基因進行上調或下調，從而對腫瘤細胞生物學行為產生影響[13]。Liu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)miR-214可通過促進PENT基因的表達，從而抑制骨肉瘤的增殖及轉移。Shrestha等[15]的研究表明，miR-204在胃癌中可同時對CKS1B、CXCL1及GPRC5A基因進行調控，從而抑制胃癌細胞的增殖與凋亡。因此，尋找惡性腫瘤中特異性表達的miRNA及其調控的下游靶基因，再轉錄水平進行外源性調控，可能是治療惡性腫瘤新的突破口。

miRNA正在成為各種基本生物過程中的關鍵參與者，并且其表達改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移特異性相關。miR-200b在許多癌癥中過度表達，如乳腺癌、胃癌和結腸直腸癌，是惡性腫瘤預后的負面因素，與轉移程度呈正相關[16-18]。miR-200家族基因主要由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429組成，自Gregory等[16]首次發(fā)現(xiàn)miR-200家族在惡性腫瘤中的表達呈抑制狀態(tài)以來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族通過調節(jié)內皮細胞間質化從而用抑制腫瘤新生的血管支持自身的能力，阻斷腫瘤的發(fā)展和轉移[17]。對于肺癌、卵巢癌、腎癌或三陰性乳腺癌，體內miR-200家族基因高表達的患者生存期較低表達患者長，其中miR-200a在三陰性乳腺癌患者體內明顯降低，體外實驗發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌細胞株中表達降低，通過抑制乳腺癌細胞凋亡，從而抑制乳腺癌的進展，但具體機制至今仍未闡明[18-19]。PDCD4是新發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡相關基因。Shibahara等[20]于1995年在小鼠身上成功克隆PDCD4，發(fā)現(xiàn)其功能上可以調節(jié)細胞的程序性死亡，也通過抑制蛋白轉錄和翻譯過程抑制腫瘤細胞生長。Kamel等[21]研究表明，PDCD4與microRNA-21在結直腸癌細胞中的表達呈負相關，通過上調PDCD4的表達，能夠發(fā)揮抑制結直腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡的作用。而miR-200b與PDCD4在乳腺癌中的表達以及是否在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用還未見報道，因此本研究通過實時定量PCR檢驗乳腺癌及正常乳腺組織中miR-200b的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-200b在乳腺癌組織中呈低表達，進一步抑制miR-200b的表達，乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力顯著增強，表明miR-200b是乳腺癌細胞中的抑癌基因，可以抑制乳腺癌細胞的增殖及侵襲。

本研究采用TargetScan、PicTar4和miRanda數據庫對miR-200b進行檢索，預測其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-200b和PDCD4間有部分相同的結合序列，推測PDCD4是miR-200b在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用的靶基因，故通過雙熒光素酶報告基因明確miR-200b和PDCD4間的調控關系。本研究將miR-200b siRNA、PDCD4 3′-UTR共轉染到乳腺癌MCF-7細胞中，結果顯示抑制miR-200b的表達后，PDCD4的表達及活性相應上調，乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力明顯增強，并且同時過表達PDCD4后PDCD4蛋白表達含量增加，乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力比之前降低，說明miR-200b可調控PDCD4基因的表達，抑制乳腺癌細胞的生物學行為，但其是否特異性靶向調控下游基因或蛋白進而抑制乳腺癌細胞的生物學行為還不得而知，也是本實驗今后繼續(xù)研究的方向。

綜上所述，miR-200b可調控PDCD4基因的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力。本實驗為miR-200b在乳腺癌細胞增殖和侵襲的作用方式和機制的闡釋提供了一定的理論基礎，也為乳腺癌的診斷和治療開辟新的治療靶點提供可能。