馬 婷 林昕怡 賈旭穎 高金偉 竇 勇 邵 蓬 周文禮

(天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

渤海灣鹵蟲是中國鹵蟲資源中的一種孤雌生殖鹵蟲，其營養(yǎng)成分堪比美國大鹽湖鹵蟲，是渤海生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。在水域生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中，鹵蟲等浮游動物聯(lián)系著初級生產(chǎn)者和消費者，藻類生長和營養(yǎng)鹽的再利用被浮游動物的濾食行為控制著，浮游動物和藻類在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡中起著重要的作用。不同投喂餌料對鹵蟲生長和成活率及自身營養(yǎng)價值的影響是鹵蟲養(yǎng)殖過程中的重要問題，鹵蟲的生長、繁殖及對養(yǎng)殖水產(chǎn)品幼苗的營養(yǎng)價值受投喂餌料的種類以及質(zhì)量的調(diào)控。在天然環(huán)境中鹵蟲主要以細菌、微藻和有機碎屑等為食，人工養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用生物餌料飼養(yǎng)，其中生物餌料中的微藻就被廣泛應(yīng)用于鹵蟲營養(yǎng)強化的各個階段，不同程度地滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖動物各個時期的生長需求和營養(yǎng)需求。在生產(chǎn)實踐中鹵蟲主要投喂球等鞭金藻、海水小球藻、酵母等生物餌料。

鹵蟲向水生動物輸送不同的營養(yǎng)物質(zhì)，其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸組成齊全，微量元素、維生素含量豐富，粗脂肪含量比較高，其中不飽和脂肪酸高于飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸對水產(chǎn)生物的發(fā)育生長、免疫防御、能量代謝有重要的影響，但鹵蟲體內(nèi)的不飽和脂肪酸含量水平較低，無法滿足多數(shù)海水魚、蝦苗種發(fā)育的需要，因此大規(guī)模生產(chǎn)中一般使用魚油、葡萄糖、花生四烯酸(ARA)進行鹵蟲脂肪酸強化，這不僅提高了養(yǎng)殖成本，而且限制了鹵蟲作為開口餌料在海水養(yǎng)殖育苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。還有一些使用植物蛋白代替魚粉降低鹵蟲的養(yǎng)殖成本，但植物蛋白中營養(yǎng)不平衡，對促進鹵蟲的生長和發(fā)育效果并不理想。宋雨晴研究了海洋單胞藻對鹵蟲生長的影響，發(fā)現(xiàn)不同餌料飼養(yǎng)鹵蟲后，鹵蟲的體長增長受餌料脂肪含量的影響更明顯；彭瑞冰等研究不同餌料對鹵蟲總脂含量、脂肪酸組成的影響，認為鹵蟲以三角褐指藻或“三角褐指藻＋酵母液”為餌料培養(yǎng)營養(yǎng)價值最佳。

目前眾多研究中，針對渤海灣鹵蟲機體脂肪酸類代謝產(chǎn)物成分的探究較少，對于渤海灣鹵蟲體內(nèi)脂肪酸的種類與數(shù)量，及不飽和脂肪酸的生物量也尚未查明。本試驗在兩種餌料環(huán)境條件下飼養(yǎng)渤海灣鹵蟲，通過液相色譜法探究渤海灣鹵蟲體脂肪酸代謝物，揭示渤海灣鹵蟲脂肪酸及相關(guān)酶的作用機制，進一步闡述鹵蟲體內(nèi)脂肪酸組分與相關(guān)酶活的關(guān)系轉(zhuǎn)換，為完善鹵蟲資源的開發(fā)及海洋經(jīng)濟動物苗種生產(chǎn)中更好利用鹵蟲提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗材料 試驗所用鹵蟲卵由天津某生物科技有限公司提供，放置于冰箱4℃密封待用。鹵蟲孵化時持續(xù)充氣，保證鹵蟲卵均勻分布，孵化水溫25℃，光照強度為72微摩爾/(米2·秒)。取時齡＞7天、體長(2.0±0.05)毫米的鹵蟲待用。

球等鞭金藻、食用酵母均由天津農(nóng)學院水生生物生態(tài)實驗室提供。藻液采用f/2培養(yǎng)基，藻液置于溫度為26℃、光照為72微摩爾/(米2·秒)、光照周期為12∶12(夜∶晝)的光照培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)。酵母為食用安琪干酵母，投喂前用海水稀釋，放置于4℃冰箱密封保存。

2.試驗方法

(1)試驗設(shè)計。將孵化好的渤海灣鹵蟲濾出，分成兩組(表1)，每組3個重復(fù)，第一組為球等鞭金藻組，第二組為酵母組。整個試驗周期中，養(yǎng)殖溫度25℃、光照強度72微摩爾/(米2·秒)、養(yǎng)殖水鹽度25、pH 8。每天投喂等量的餌料，即投喂密度為(1.0±0.2)×106個/毫升，保證鹵蟲充足攝食。在培養(yǎng)第7天取樣放置-80℃保存，待用于測定渤海灣鹵蟲脂肪酸及相關(guān)酶活力。

表1 鹵蟲試驗培養(yǎng)方案

(2)數(shù)據(jù)測定方法。鹵蟲體脂肪酸測定方法參考GB 5009.168-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》。脂肪酸相關(guān)酶活力及三磷酸腺苷、游離脂肪酸含量測定均采用南京建成試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行測定。脂肪酶(LPS)也稱三?；视王；饷福玫孜锓磻?yīng)及生成速率反映LPS的活性。脂肪酸合成酶(FAS)通過還原反應(yīng)產(chǎn)生棕櫚酸的量測定。游離脂肪酸(NEFA)是根據(jù)其與輔酶A在乙酰輔酶A合成酶(ACS)作用下反應(yīng)生成乙酰輔酶A的反應(yīng)，得到NEFA的含量。三磷酸腺苷(ATP)含量是通過肌酸激酶催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸的方法得到。

3.數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2010和Origin 8.0軟件繪制圖形，利用SPSS軟件進行單因素方差分析鑒定數(shù)據(jù)差異性，P＜0.05為顯著性差異水平。

二、結(jié)果與分析

1.餌料對渤海灣鹵蟲脂肪酸的影響 餌料對渤海灣鹵蟲脂肪酸組成及含量的影響試驗結(jié)果表明，球等鞭金藻組鹵蟲體脂肪酸總量最大(62260.2毫克/千克)，顯著高于酵母組(P＜0.05)；酵母組脂肪酸總含量僅在44331.9毫克/千克。脂肪酸主要由飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸組成，球等鞭金藻組的飽和脂肪酸含量最高，為11617.6毫克/千克，顯著高于酵母組(P＜0.05)；就單不飽和脂肪酸含量看，球等鞭金藻組與酵母組鹵蟲體內(nèi)單不飽和脂肪酸含量相差不大，范圍在16995.9～17789.4毫克/千克；球等鞭金藻組鹵蟲多不飽和脂肪酸含量高達33646.8毫克/千克，為酵母組的1.98倍，顯著高于酵母組(P＜0.05)。表2中球等鞭金藻的二十碳五烯酸(EPA)、ω-3多不飽和脂肪酸(DHA)、花生四烯酸(ARA)含量顯著高于酵母組(P＜0.05)，EPA含量約為酵母組的3倍，DHA含量為酵母組的2.84倍，ARA含量為酵母組的1.47倍(表2)。

2.餌料對渤海灣鹵蟲脂肪酸相關(guān)酶的影響?zhàn)D料對渤海灣鹵蟲脂肪酸相關(guān)酶活研究表明，球等鞭金藻組鹵蟲脂肪酶活力最高，為24.8個活力單位，約為酵母組的1.85倍，顯著高于酵母組(P＜0.05)。酵母組鹵蟲的游離脂肪酸含量顯著高于球等鞭金藻組(P＜0.05)，為其3.82倍。球等鞭金藻組鹵蟲脂肪酸合成酶的含量略高于酵母組，相差僅為0.53微摩爾/毫升，兩組間無顯著差異(P＞0.05)。

表2 鹵蟲EPA、DHA、ARA的含量 毫克/千克

球等鞭金藻組鹵蟲體內(nèi)的ATP含量最高，為259.23微摩爾/克蛋白，高酵母組鹵蟲體內(nèi)ATP含量的1.42倍，顯著高于酵母組(P＜0.05)。

三、討論

餌料為水產(chǎn)生物提供主要代謝能量來源，對水生生物的發(fā)育、生長與繁殖有重要影響。餌料對鹵蟲生長、生殖的影響大部分的研究側(cè)重于啤酒酵母、混合單胞藻、螺旋藻粉、農(nóng)副產(chǎn)品(如米糠、麩皮、豆粕等)、植物漿等對鹵蟲的餌料效果，試驗結(jié)果表明：在鹵蟲生長前期，農(nóng)副產(chǎn)品飼養(yǎng)鹵蟲的生長速度高于其他種類飼料，在鹵蟲生長的中后期混合單胞藻和螺旋藻粉對鹵蟲的生長和存活高于其他餌料，而酵母對鹵蟲的影響最差，各試驗組鹵蟲體代謝和耗能情況出現(xiàn)較大差異。Watanabe T等研究發(fā)現(xiàn)生物餌料飼養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)脂肪酸組成成分的種類與數(shù)量都顯著優(yōu)于普通餌料飼養(yǎng)的鹵蟲。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖上一般通過改變餌料來提高水產(chǎn)品脂肪酸的含量，較大程度地改善魚等水產(chǎn)品生長發(fā)育需求。鹵蟲的無節(jié)幼體被廣泛應(yīng)用于蝦、蟹、海水魚、淡水魚及觀賞動物幼體養(yǎng)殖方面，是應(yīng)用最廣的生物開口餌料，提高鹵蟲體內(nèi)的脂肪酸成分，有利于水產(chǎn)動物幼苗的生長、發(fā)育和抗病率的提高，改善魚蝦的成熟和提高產(chǎn)卵率。試驗中球等鞭金藻組的鹵蟲脂肪酸總含量顯著高于酵母組，其中該組不飽和脂肪酸含量是酵母組的近兩倍，可見球等鞭金藻喂養(yǎng)的鹵蟲脂肪酸含量有顯著的提升。

脂肪酶是探究生物機體消化酶活力的重要參考指標之一，同時也是參與生物機體代謝活動的主要酶類。試驗中球等鞭金藻試驗組的鹵蟲脂肪酶活力較高，能夠正常維持鹵蟲代謝活動，促進鹵蟲的生長與發(fā)育；而酵母組鹵蟲脂肪酶活力較低，體代謝速度降低，生長發(fā)育緩慢。脂肪酸合成酶(FAS)作為一種合成脂肪酸的關(guān)鍵酶，具有豐富的酶系統(tǒng)功能，在生物機體的能量代謝中發(fā)揮著極大作用。試驗中球等鞭金藻組的鹵蟲脂肪酸合成酶含量略高于酵母組，這一現(xiàn)象說明餌料對FAS僅有較低的影響，基于楊文平等試驗基礎(chǔ)上可能與鹵蟲機體自身的脂肪酸合成酶mRNA表達量有較大關(guān)系。三磷酸腺苷(ATP)是生物機體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的基本載體，伴隨著生物生長、發(fā)育、凋亡等各個過程的重要能量分子，ATP含量變化直接影響各成分的能量代謝，而游離脂肪酸是在機體ATP不能維持正常運轉(zhuǎn)時由脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)換的一種能源物質(zhì)。本試驗中球等鞭金藻組鹵蟲體內(nèi)ATP能量供應(yīng)充足，該組游離脂肪酸較低；而酵母組鹵蟲ATP能量較低，游離脂肪酸含量較高，這是由于鹵蟲機體的代謝功能出現(xiàn)障礙，為維持自身活動所需物質(zhì)，機體脂質(zhì)組織分解脂類物質(zhì)為游離脂肪酸，進而充當能源用于基礎(chǔ)代謝維持生命活動。

在本研究條件下，球等鞭金藻組更為適宜作為鹵蟲脂肪酸強化的飼料，鹵蟲的脂肪酸總含量、各組成成分均增長顯著，同時鹵蟲體內(nèi)脂肪酶含量較高，機體ATP較高，滿足自身代謝功能，且不需要將自身脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸以提供生物代謝所需的能量，但具體鹵蟲體內(nèi)的脂肪酸代謝及生物合成的機理還需進一步探究。