胡 婕 陳 偉 盧 平 程雙華 李 燦

成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，核工業(yè)四一六醫(yī)院，四川成都，610051

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)起源于表皮或附屬器的角質(zhì)形成細(xì)胞，是常見的非黑素瘤皮膚惡性腫瘤之一[1]，患者行手術(shù)切除后5年生存率高于90%，但易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。而角化棘皮瘤(keratoacanthoma，KA)是一種少見的皮膚鱗狀細(xì)胞增生性腫瘤，具有生長快、可自行消退的特點(diǎn)，它在臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)上與高分化的cSCC難以區(qū)分。KA究竟是cSCC的特殊類型還是一種獨(dú)立的皮膚腫瘤，目前還存在爭議。程序性死亡因子配體-1(programmed death factor ligand-1, PD-L1)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[3-5]，是目前免疫治療最重要的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過免疫組化染色(IHC)檢測PD-L1在cSCC和KA中的表達(dá)情況，分析其與cSCC和KA臨床病理參數(shù)的關(guān)系，初步探討PD-L1在cSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，為cSCC的免疫治療尋找新靶點(diǎn)，并分析PD-L1能否有效區(qū)分cSCC和KA。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年2月至2019年12月在我院皮膚科行手術(shù)治療的皮膚鱗狀細(xì)胞癌及角化棘皮瘤患者共88例。cSCC共56例，男37例，女19例，年齡33～79歲，平均(65.78±11.93)歲。根據(jù)Broders病理分級分組：I組(I級)34例，II/III組(II級/III～I(xiàn)V級)22例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無轉(zhuǎn)移18例。腫瘤位置：曝光部位(面、頸)30例，非曝光部位(背、胸、四肢及會陰)26例。KA共32例，男18例，女14例，年齡46～84歲，平均(66.64±9.05)歲。腫瘤位置：曝光部位(面、頸)21例，非曝光部位(前胸、四肢及會陰)11例。另選取同期在我院行美容整形手術(shù)的32例正常皮膚組織切片作為對照組。各組在性別、年齡方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)標(biāo)本均來源于手術(shù)完整切除的瘤體；(2)所有患者均為首次發(fā)病，術(shù)前未行其他治療；(3)患者病歷資料完整，年齡、性別、皮損部位不限；(4)所有受試者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)來源于皮膚活檢的標(biāo)本；(2)合并其他腫瘤或相關(guān)疾病者；(3)合并心腦血管、自身免疫性疾病不能耐受手術(shù)者；(4)組織病理學(xué)診斷不明確者。

本研究患者或家屬簽署知情同意書，且研究方法遵循倫理學(xué)規(guī)定，上報本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑與儀器 免疫組化染色試劑盒(SP法)購于邁新公司，貨號：191212s457m；兔抗人PD-L1一抗購于DAKO公司；貨號：M3653；EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī)均購于Leica公司；光學(xué)顯微鏡型號為Nikon50i。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測PD-L1表達(dá) 將保存的石蠟切片脫蠟、水化后，采用免疫組化SP法檢測組織切片中PD-L1蛋白的表達(dá)，具體按照全自動免疫組化染色機(jī)(Titan，邁新)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行。

PD-L1染色結(jié)果判斷：采用半定量分級法，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比積分。每張病理組織切片的全部視野均需觀察：(1)染色強(qiáng)度分級：0分(無著色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)；(2)陽性細(xì)胞百分比分級：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(>75%)。最終得分=染色強(qiáng)度分級評分×陽性細(xì)胞百分比分級評分，結(jié)果分為4組：<2分，陰性(-)；2～3分，弱陽性(+)；4～6分，陽性(++)；>6分，強(qiáng)陽性(+++)。由兩位病理科資深醫(yī)師采用盲法進(jìn)行打分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)法對各組計量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較；計數(shù)資料采用“%”表示，采用χ2檢驗(yàn)法對各組計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)對比，當(dāng)n<40，且有格子的理論頻數(shù)<5時，采用Fisher確切概率法直接計算累計概率。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1在各組中表達(dá)情況的比較 PD-L1在cSCC組的陽性率(66.07%)及KA組中的陽性率(62.50%)均顯著高于正常對照組(9.38%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但cSCC與KA組間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖1)。

注：cSCC組vs正常對照組：P<0.01;KA組vs正常對照組：P<0.01;cSCC組vs KA組：χ2=1.240，P>0.05

2.2 PD-L1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組內(nèi)表達(dá)情況的比較 PD-L1在Broders分級分組II/III組中的陽性率(81.82%)高于I組(55.88%)，斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)為-0.412，說明PD-L1的表達(dá)與cSCC的分化程度呈負(fù)相關(guān)，即cSCC分化越差PD-L1表達(dá)越強(qiáng)，分化越好PD-L1表達(dá)越弱，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖2)。

表2 PD-L1在cSCC組內(nèi)表達(dá)情況的比較

注：χ2=9.354，P<0.05；斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)為-0.412，P<0.01

3 討論

程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)又名CD274，是一種50～55KD的I型跨膜糖蛋白，屬于B7/CD28協(xié)同刺激分子超家族的重要成員。正常情況下，PD-1在活化的CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC表面廣泛表達(dá)，對維持機(jī)體的免疫耐受有重要作用[6]。而在惡性腫瘤的發(fā)生過程中，淋巴細(xì)胞表面的PD-1與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1結(jié)合形成PD-1/PD-L1信號通路，通過激活SHP-2，抑制Zap70蛋白的磷酸化水平，上調(diào)ERK等蛋白表達(dá)，進(jìn)而釋放NF-κB因子，降低腫瘤局部微環(huán)境中T細(xì)胞的免疫效應(yīng)[7]，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸，并與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。有針對性的阻斷PD-1/PD-L1通路，可以增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。近年來，PD-1和PD-L1抑制劑逐漸應(yīng)用于非小細(xì)胞型肺癌(NSCLS)、腎細(xì)胞癌、皮膚黑素瘤和默克爾細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤，并且取得了良好的治療效果，一時之間PD-L1作為腫瘤免疫治療重要的生物學(xué)標(biāo)志而備受關(guān)注，但關(guān)于cSCC和KA的報道少見。

1a,1b:cSCC I組(HE,×40;IHC,×100);1c,1d:KA組(HE,×40;IHC,×100)圖1 PD-L1在cSCC組和KA組中表達(dá)的情況

2a:cSCC I組(HE，×200);2b:cSCC II組(HE，×200);1c:cSCC III組(HE，×200);2d:cSCC I組(IHC，×400);2e:cSCC II組(IHC，×400);2f:cSCC III組(IHC，×400)圖2 PD-L1在cSCC不同分級組內(nèi)表達(dá)情況

cSCC來源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞，又稱為棘細(xì)胞癌，好發(fā)于日光損傷部位，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，治療主要依靠手術(shù)切除或者放療。目前研究認(rèn)為cSCC的發(fā)病機(jī)制與紫外輻射、免疫抑制等多因素有關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過抑制T細(xì)胞活性，釋放免疫炎癥因子等方式逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)測，進(jìn)而不斷增殖，加速腫瘤進(jìn)展[9]。T細(xì)胞浸潤在cSCC中普遍存在，T細(xì)胞受體與配體間的相互作用后可調(diào)控T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的免疫效能。深入探究影響cSCC的免疫機(jī)制，對尋找cSCC的免疫治療靶標(biāo)具有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在cSCC患者腫瘤組織中陽性表達(dá)率為66.07%，顯著高于正常對照組的9.38%(P<0.05)，這表明PD-1/PD-L1信號通路介導(dǎo)的免疫抑制可能參與了cSCC的發(fā)病。同時我們發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與cSCC的組織病理分化程度呈負(fù)相關(guān)，即cSCC分化越差PD-L1表達(dá)越強(qiáng)，分化越好PD-L1表達(dá)越弱，這一結(jié)果提示cSCC患者的治療方案除了選擇手術(shù)切除或放療以外，在不遠(yuǎn)的未來還可能會依據(jù)腫瘤組織中PD-L1表達(dá)的情況，為患者選擇個體化的治療方案。針對PD-1/PD-L1的免疫治療藥物已逐步應(yīng)用于宮頸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及食管癌等腫瘤的治療中，我們的研究表明PD-L1可能成為cSCC免疫治療的新靶點(diǎn)。

KA是一個具有爭議的腫瘤實(shí)體，絕大多數(shù)KA發(fā)生在有毛發(fā)的皮膚，從而推測KA來源于毛囊上皮細(xì)胞，它的消退可能與毛囊周期有關(guān)。cSCC和KA無論是臨床表現(xiàn)還是組織病理學(xué)表現(xiàn)都非常相似，特別是高分化的cSCC和KA之間鑒別困難。最初認(rèn)為KA是一種伴有明顯角化的上皮良性增生性病變，可自愈，生長迅速，數(shù)月后可自行消退，不需手術(shù)治療[10]，部分學(xué)者認(rèn)為KA具有獨(dú)特的臨床和組織學(xué)特征，應(yīng)是一種獨(dú)立存在的疾病[11]。但是隨著研究的深入，又發(fā)現(xiàn)KA有潛在的癌變傾向，少數(shù)可惡變?yōu)閏SCC，卻極少發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]，因此2004年Hurt等[13]提出KA是cSCC的一種亞型，應(yīng)將其定義為高分化鱗狀細(xì)胞癌(角化棘皮瘤型)。在2006版WHO皮膚腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)中KA被歸入棘皮瘤，ICD-O編碼：8071/1[14]，而2018版WHO中KA被首次歸入鱗狀細(xì)胞癌，ICD-O編碼由8071/1變更為8071/3，這表明其生物學(xué)行為由良性或惡性未肯定，明確修訂為惡性[15]，同義詞包括：高分化鱗狀細(xì)胞癌(角化棘皮瘤型)、角化棘皮瘤樣鱗狀細(xì)胞癌。這似乎表明KA應(yīng)視為cSCC的一種特殊類型，但是2018版WHO依舊保留了“角化棘皮瘤”這個診斷，并且提出雖然cSCC和KA擁有同樣的致癌基因MAP3K8(TPL2)，但是KA與cSCC的遺傳學(xué)特征仍存在不同[15]。Ra等[16]的研究也證實(shí)KA特有的基因表達(dá)譜系分析提示其與鱗狀細(xì)胞癌在分子上是不同的。雖然目前已有研究提出Ki-67[17]、bcl-2[18]、p53等生物分子表達(dá)的差異可能有助于區(qū)分cSCC和KA，但尚未發(fā)現(xiàn)具有高度特異性和敏感性的分子標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在KA腫瘤細(xì)胞表達(dá)的陽性率為62.50%，顯著高于正常對照組(P<0.01)，這說明PD-1/PD-L1信號通路上調(diào)可能也參與了KA的發(fā)病，但PD-L1在cSCC組與KA組的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此PD-L1仍舊不能有效的區(qū)分cSCC和KA。

綜上所述，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，引起腫瘤微環(huán)境中免疫監(jiān)視功能的降低，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，PD-1/PD-L1信號通路可能參與了cSCC和KA的發(fā)病。PD-L1與cSCC的分化程度呈負(fù)相關(guān)，分化越差PD-L1表達(dá)越強(qiáng)，PD-L1可能成為cSCC免疫治療的一個新靶點(diǎn)。PD-L1在cSCC和KA中的表達(dá)沒有差異性，更為支持KA可能是cSCC的一種特殊類型。由于本研究納入的病例數(shù)量較少，且目前對于PD-L1免疫組化染色結(jié)果的判讀尚未達(dá)成廣泛共識，這可能會對結(jié)果造成一定的影響，因此后期仍需擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)積累經(jīng)驗(yàn)，力爭為cSCC和KA的診療提供更加充分、全面的論據(jù)。