類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清14-3-3η蛋白及其mRNA表達(dá)水平與關(guān)節(jié)損傷的關(guān)系①

周 濤 許超平 肖 穎 張 倩 鄭麗芳 (武漢市普仁醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢 430081)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的自身免疫性疾病，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎、軟骨降解、骨質(zhì)破壞等[1]。由于RA可導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾，嚴(yán)重影響患者日常生活質(zhì)量；此外，RA還可引起全身并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者健康[2]。目前臨床以檢測患者自身抗體(類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸抗體等)水平，并結(jié)合影像學(xué)檢查診斷RA和分型分期，但誤診、漏診概率較大，延誤患者病情[3]。14-3-3蛋白主要表達(dá)于真核生物細(xì)胞，其分子序列高度保守，是細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的伴侶蛋白，共同調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架的運(yùn)輸?shù)冗^程[4]。近幾年，國內(nèi)外研究顯示，其亞型14-3-3η蛋白參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，對RA的診斷及預(yù)后有重要作用[5,6]；但14-3-3η蛋白與RA患者關(guān)節(jié)損傷的關(guān)系報道較少，對其作用機(jī)制不明。故本文旨在探究14-3-3η蛋白及其mRNA表達(dá)水平與關(guān)節(jié)損傷的關(guān)系，為RA患者的辨別和良好預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年12月武漢市普仁醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的RA患者158例，參考文獻(xiàn)[7]分為早期RA(病程≤1年)80例，非早期RA(病程>1年)78例，另招募同期體檢健康者50例為對照組。對照組年齡28～72歲，平均年齡(51.24±12.35)歲；男16例，女34例；平均身高(163.27±6.58)cm，平均體重(57.43±8.62)kg。早期RA患者年齡19～63歲，平均年齡(49.83±11.26)歲；男24例，女56例；平均身高(162.81±7.06)cm，平均體重(58.52±9.14)kg。非早期RA患者年齡21～60歲，平均年齡(51.63±12.84)歲；男23例，女55例；平均身高(162.52±8.09)cm，平均體重(56.22±8.34)kg。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，本研究已獲得武漢市普仁醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可，所有受試者均知情且同意參與。

1.1.2儀器 超速離心機(jī)(德國Effendrof公司)，ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，超微量核酸分析儀(德國Jena公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，熒光染料(美國ABI公司)，qRT-PCR儀(美國BioRad公司)，引物序列(由上海信帆生物科技有限公司提供)，3.0T磁共振掃描儀(德國Philips公司)。

1.2方法

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：RA患者符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會提出的RA分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；健康對照組受試者體征正常，各項(xiàng)常規(guī)檢查無異常；依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：重要器官(心、肝、腎等)功能障礙；合并糖尿病、甲狀腺疾病、血液疾病、惡性腫瘤等慢性?。粐?yán)重感染；妊娠、哺乳期婦女。

1.2.2臨床資料的記錄 詳細(xì)記錄研究對象的一般資料(年齡、身高、體重等)。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸抗體(anti-cyclic citrullinated peptides antibody，抗CCP 抗體)等 。

1.2.3ELISA檢測血清14-3-3η蛋白濃度 于早間空腹采集受試者外周靜脈血3 ml，應(yīng)用超速離心機(jī)以2 000 r/min離心5 min，上清即為血清，若不及時檢測可置于-80℃冰箱凍存。參照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測血清14-3-3η蛋白濃度。

1.2.4qRT-PCR檢測血清14-3-3η mRNA濃度 取出凍存血清，解凍后加入適量Trizol裂解液，提取血清總RNA；經(jīng)超微量核酸分析儀檢測提取物純度和濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA模板；混入熒光染料，上qRT-PCR儀進(jìn)行檢測，引物序列見表1。參數(shù)設(shè)置：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后觀察溶解曲線判斷引物序列特異性，采用2-ΔΔCt法，以GADPH基因的表達(dá)量為內(nèi)參，計算血清14-3-3η mRNA的相對表達(dá)量，作3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

表1 引物序列[9]

Tab.1 Primer sequences[9]

GeneSequenceGAPDHF:GAAGGTGAAGGTGGGAGTR:GAAGATGGTGATGGGATTTC14-3-3ηF:TCGATGATGCCATAGCTGAGR:GCTTCTTCATCCTGCTGGTC

1.2.5RAMRIS系統(tǒng)評分 采用3.0 T磁共振掃描儀檢查RA患者受累關(guān)節(jié)，參照OMERACT RAMRIS評分系統(tǒng)分析 MRI圖像，評價患者滑膜炎、骨髓水腫、骨侵蝕等關(guān)節(jié)損傷，具體細(xì)則如下：①滑膜炎評分，正常為0分，強(qiáng)化范圍為滑膜總體積(或厚度)的1/3計為1分，強(qiáng)化范圍為滑膜總體積(或厚度)的2/3計為2分，強(qiáng)化范圍為滑膜總體積(或厚度)的全層計為3分；②骨髓水腫評分，無水腫為0分，骨髓水腫體積<33%計為1分，骨髓水腫體積34%～66%計為2分,骨髓水腫體積達(dá)67%～100%計為3分；③骨侵蝕評分：無侵蝕為0分，骨侵蝕體積<10%計為1分，骨侵蝕體積達(dá)11%～20%計為2分，骨侵蝕體積達(dá)21%～30%計為3分，依次類推計分[10]。以上評分過程由2名資深影像學(xué)醫(yī)師進(jìn)行測評，以均值為最終結(jié)果。

1.2.6疾病活動度評價 采用28個關(guān)節(jié)腫脹關(guān)節(jié)個數(shù)、28個關(guān)節(jié)壓痛關(guān)節(jié)個數(shù)及28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(DAS28)評價RA患者疾病活動度[11]。

2 結(jié)果

2.1兩組血清14-3-3η蛋白及mRNA、CRP、RF和抗CCP抗體水平的比較 RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA、ESR、CRP、RF和抗CCP 抗體水平均顯著高于正常對照組(均P<0.05)，見表2。

2.2ROC工作曲線分析 如圖1，將血清14-3-3η蛋白、CRP、RF和抗CCP 抗體等變量納入ROC曲線，分析各指標(biāo)診斷RA的價值，結(jié)果顯示，14-3-3η蛋白濃度≥1.37 ng/ml時，ROC曲線下面積(AUC)為0.824，靈敏度為84.00%，特異度為81.00%；CRP≥5.98 mg/L時，AUC為0.672，靈敏度為66.00%，特異度為78.50%；RF≥51.93 U/ml時，AUC為0.706，靈敏度為76.00%，特異度為73.40%；抗CCP抗體≥60.86 U/ml時，AUC為0.774，靈敏度為78.00%，特異度為77.20%；見表3。

2.3不同病程RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA表達(dá)水平的比較 非早期RA組14-3-3η蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著高于早期RA組(P<0.05)，見表4。

2.4RA患者關(guān)節(jié)損傷情況 RA患者DAS28評分(7.58±1.58)分，28個關(guān)節(jié)腫脹關(guān)節(jié)(13.49±3.42)個，28個關(guān)節(jié)壓痛關(guān)節(jié)(12.73±3.16)個；滑膜炎評分(1.75±0.86)分，骨髓水腫評分(1.48±0.51)分，骨侵蝕評分(3.26±1.43)分。63例患者出現(xiàn)滑膜炎，累及131個關(guān)節(jié)區(qū)，其中腕骨間+腕掌關(guān)節(jié)區(qū)出現(xiàn)滑膜炎損傷最多，有53個(40.46%)，其他分別為遠(yuǎn)端橈尺關(guān)節(jié)區(qū)34個，掌指關(guān)節(jié)區(qū)30個，橈腕關(guān)節(jié)區(qū)14個。43例患者出現(xiàn)骨髓水腫，累及122塊骨，其中腕骨出現(xiàn)骨髓水腫最多，有65塊(53.28%)，包括25塊頭狀骨、12塊三角骨、12塊鉤骨、10塊月骨、5塊舟骨及1塊大多角骨， 其他骨髓水腫發(fā)生于近節(jié)指骨近端21塊、 橈骨遠(yuǎn)端10塊、掌骨遠(yuǎn)端7塊、近節(jié)指骨遠(yuǎn)端7塊、掌骨近端6塊及尺骨遠(yuǎn)端6塊。67例患者出現(xiàn)骨侵蝕，累及201塊骨，其中腕骨出現(xiàn)骨侵蝕最多，有145塊(72.14%)，包括69塊頭狀骨、23塊三角骨、36塊舟骨、17塊月骨，其他骨侵蝕發(fā)生于掌骨遠(yuǎn)端27塊、近節(jié)指骨遠(yuǎn)端9塊、橈骨遠(yuǎn)端8塊、掌骨近端8塊及近節(jié)指骨近端4塊。

Groupsn14-3-3η(ng/ml)14-3-3η mRNACRP(mg/L)RF(U/ml)Anti-CCP antibody(U/ml)Control500.58±0.260.43±0.123.67±1.6515.27±5.3818.34±6.82RA1585.67±1.961)1.16±0.291)16.27±6.541) 85.53±24.161) 247.19±58.431)F18.28317.31413.46720.37227.590P0.0000.0000.0000.0000.000

Note:Compared with control group，1)P<0.05.

2.5血清14-3-3η蛋白表達(dá)與實(shí)驗(yàn)室及關(guān)節(jié)損傷指標(biāo)相關(guān)性分析 RA患者血清14-3-3η蛋白與CRP水平、滑膜炎評分、骨髓水腫評分、DAS28評分、28個關(guān)節(jié)腫脹關(guān)節(jié)個數(shù)及壓痛關(guān)節(jié)個數(shù)呈正相關(guān)(r/P=0.462/0.039，0.427/0.045，0.384/0.017，0.528/0.032，0.451/0.008，0.419/0.027)，與RF、抗CCP水平及骨侵蝕評分無明顯相關(guān)性(均P>0.05)。

圖1 ROC工作曲線分析Fig.1 ROC curves analysis

表3 14-3-3η和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)診斷評價

Tab.3 Diagnosis of 14-3-3η and laboratory test indexes

VariableAUCSensitivity(%)Specificity(%)95%CI14-3-3η0.82484.0081.000.749-0.898CRP0.67266.0078.500.578-0.766RF0.70676.0073.400.621-0.790Anti-CCP antibody0.77478.0077.200.693-0.854

Groupsn14-3-3η(ng/ml)14-3-3η mRNAEarly RA803.24±1.170.83±0.24Non-Early RA787.54±2.431)1.51±0.331)t14.22714.840P0.0000.000

Note:Compared with early RA，1)P<0.05.

3 討論

14-3-3η蛋白空間結(jié)構(gòu)呈U形，通過U形內(nèi)部高度保守序列結(jié)合相應(yīng)靶蛋白，參與多種疾病的生物調(diào)節(jié)過程，如癌癥、心血管疾病、糖尿病等[12-14]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)14-3-3η蛋白可激活MAPK/ERK、SAPK/JNK 及JAK-STAT等通路增加促炎細(xì)胞因子(如白介素6、腫瘤壞死因子α等)的分泌，具有促炎作用[15]。van Beers-Tas MH等[16]研究顯示，14-3-3η蛋白可能通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和C-Jun氨基末端激酶，參與RA的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示RA患者血清14-3-3η蛋白及mRNA水平均顯著高于健康對照組，提示14-3-3η蛋白可作為鑒別RA的生物標(biāo)記物，與曾婷婷[17]等研究報道一致。

RA患者實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)主要有C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸抗體(anti-cyclic citrullinated peptides antibody，抗CCP 抗體)等。RA臨床特征為炎性滑膜炎，CRP 可反映體內(nèi)炎癥水平，但對于RA僅能起到初步篩選的作用[18]。RF是首個用于診斷RA的血清因子，具有檢測簡單易操作、陽性率較高等優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)其他感染性疾病及自身免疫病患者中也可檢出，特異度較低，對不典型RA患者篩查能力較弱[19]。后來發(fā)現(xiàn)抗CCP 抗體水平對RA診斷有較高的價值[20]。通過繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)14-3-3η蛋白濃度≥1.37 ng/ml時，ROC曲線下面積(AUC)為0.824，靈敏度為84.00%，特異度為81.00%，診斷價值最高；相關(guān)性分析顯示，RA患者血清14-3-3η蛋白與CRP水平呈正相關(guān)，可能與14-3-3η蛋白作用機(jī)制有關(guān)[21]。表明血清14-3-3η蛋白在RA的診斷中具有一定的價值，可作為RA實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的補(bǔ)充標(biāo)記物。

核磁共振掃描可以清楚顯示關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、骨髓、肌腱及韌帶等結(jié)構(gòu)，有利于及時發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔積液、滑模炎癥增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨髓水腫等病癥，對早期RA患者關(guān)節(jié)損傷有較大的優(yōu)勢[22]。本研究通過OMERACT RAMRIS評分系統(tǒng)分析 MRI圖像，評價患者關(guān)節(jié)損傷，發(fā)現(xiàn)158例RA患者均伴有不同程度的滑膜炎、骨髓水腫、骨侵蝕等損傷，大多集中在腕部。另外，相關(guān)性分析顯示，RA患者血清14-3-3η蛋白與滑膜炎評分、骨髓水腫評分、DAS28評分、28個關(guān)節(jié)腫脹關(guān)節(jié)個數(shù)及壓痛關(guān)節(jié)個數(shù)呈正相關(guān)。同時，非早期RA組14-3-3η蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著高于早期RA組，以上結(jié)果均顯示，血清14-3-3η蛋白能夠一定程度上預(yù)測RA的關(guān)節(jié)損傷程度，目前，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道，故還需要多中心擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清14-3-3η 蛋白可有效辨別RA患者，與患者關(guān)節(jié)損傷程度密切相關(guān)，有助于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷和病情的預(yù)測。但14-3-3η 蛋白在RA中的具體作用機(jī)制還需要繼續(xù)探究，以期為RA患者提供新的治療方向。