miR-1-3p在食蟹猴心肌損傷中表達(dá)水平及其與CK-MB、cTnI和NT-proBNP的相關(guān)性

姜惠敏，惠汝太，汪巨峰

0 引言

藥物致心臟毒性所引起的疾病即藥物性心肌病，是臨床醫(yī)生用藥的常見(jiàn)問(wèn)題。雖然藥物上市前經(jīng)過(guò)非常嚴(yán)格的臨床前和臨床安全評(píng)價(jià)，但是仍有很多治療性藥物因引起未預(yù)見(jiàn)的心血管毒性反應(yīng)被召回或停用[1]，故篩選一種或幾種特異性藥物性心肌病的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于降低藥物的死亡率和致殘率，提高新藥的臨床前安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。由于目前藥物性心肌病常見(jiàn)的標(biāo)志物肌鈣蛋白、肌酐激酶等，存在“滯后性”、“特異性和敏感性”尚較差的問(wèn)題[2-3]，因此，尋找和發(fā)現(xiàn)理想的藥物致心臟毒性生物標(biāo)志物，以便用來(lái)預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)藥物致心臟毒性反應(yīng)已勢(shì)在必行。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種包含19～25個(gè)核苷酸序列的高度保守非編碼小RNA，其主要通過(guò)抑制mRNA的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性發(fā)揮其生理作用[4]。目前，循環(huán)miRNA作為癌癥、心肌損傷、腎臟損傷和肝臟損傷檢測(cè)的潛在標(biāo)志物已經(jīng)得到初步驗(yàn)證并被認(rèn)可，然而，在藥物致心臟損傷中，循環(huán)miRNA作為生物學(xué)標(biāo)志物的研究尚剛起步，其應(yīng)用于臨床前和臨床藥物的安全評(píng)價(jià)還需要進(jìn)一步研究和定性[5-8]。miR-1在調(diào)控心臟發(fā)育和參與相關(guān)疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要意義，是心臟特異性表達(dá)最高的miRNA之一[9-11]，多項(xiàng)研究表明，miR-1不僅在心血管系統(tǒng)發(fā)育、血管生成過(guò)程中發(fā)揮作用，而且參與了心肌梗死、心肌肥大、心肌纖維化和心臟重塑等病理過(guò)程[12-14]，但尚未檢索到在藥物致心臟毒性模型中miR-1表達(dá)相關(guān)文獻(xiàn)。本研究通過(guò)給予食蟹猴靜脈注射多柔比星造成心肌損傷模型，監(jiān)測(cè)給予多柔比星的食蟹猴外周血循環(huán)中miR-1的變化，探討其在藥物致心臟毒性損傷診斷中的作用，以期為臨床前和臨床藥物引起心臟毒性檢測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 3～5歲普通級(jí)雄性食蟹猴(體重3.0～4.0 kg)17只，均購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(J2015-0027)]；采用Toxstat 2006軟件，根據(jù)動(dòng)物體重，按分層隨機(jī)化分組法分為2組，對(duì)照組7只，靜脈注射生理鹽水2.5 ml/kg每周，連續(xù)4周；實(shí)驗(yàn)組10只，給予鹽酸多柔比星注射液2.5 mg/kg每周(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，10 mg，批號(hào):H44024359)，給藥體積2.5 ml/kg，連續(xù)4周。動(dòng)物金屬籠單籠飼養(yǎng)，房間溫度16～26 ℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)8～10次/h，12 h照明，每天定量給食，自由攝食[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(J2015-0011)]。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及儲(chǔ)存 血標(biāo)本采集：4周后采集食蟹猴外周血漿標(biāo)本2.5 ml(需隔夜禁食)，其中0.5 ml置于冰上預(yù)冷的EDTA抗凝離心管中，30 min之內(nèi)4 ℃離心后分離血漿(3 000×g，10 min)；剩余2 ml血液，不抗凝，自然放置30 min后，離心后輕取上層血液，以上樣本均放于-80 ℃凍存。心臟組織標(biāo)本采集：處死食蟹猴取心臟后經(jīng)液氮凍存和研缽磨碎或用組織勻漿器打碎后參照“1.2.2”項(xiàng)方法提取miRNA。

1.2.2 血漿及心臟組織中miR-1-3p的檢測(cè) 使用TaqmanTMmirVanaTM-PARISTMKit(Life Technologies公司)進(jìn)行抽提。簡(jiǎn)要步驟如下:取200 μl樣品于1.5 ml無(wú)RNase的離心管中，加入800 μl的TRIZOL試劑，混勻，室溫放置5 min；加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清于另一無(wú)RNase的離心管中，加入等體積的異戊醇，-20 ℃過(guò)夜；第2天4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，洗滌沉淀；棄上清，將沉淀晾干,加入30 μl的DEPC水溶解miRNA；按照miRcut miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作獲取cDNA[天根生化科技(北京)有限公司]；miRcut miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。引物購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司miRNA引物庫(kù)，選用U6作為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下:miR-1-3p-3p,53-uggaauguaaagaaguauguau-74′;U6，5′-CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用ABI 7000軟件進(jìn)行分析，將ΔCt值作為樣本表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和N末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)的檢測(cè) MILLIPLEX MAP Human CVD Panel 1(Cat. No. HCVD1MAG-67K，購(gòu)自Merck millipore，內(nèi)含CK-MB、cTnI、NT-proBNP檢測(cè))，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并運(yùn)用液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)(LuminexTM200，美國(guó))進(jìn)行參數(shù)指標(biāo)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 食蟹猴心肌損傷模型的構(gòu)建 由圖1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比較，靜脈注射鹽酸多柔比星注射液的食蟹猴，心肌細(xì)胞發(fā)生變性和脂肪空泡化，甚至部分心肌細(xì)胞發(fā)生壞死，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；且依據(jù)心臟組織病理學(xué)病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，提示模型建立成功。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 食蟹猴心肌組織H&E染色

表1 食蟹猴靜脈注射表柔比星心臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

組織病理學(xué)改變對(duì)照組表柔比星(5 mg/kg)心臟空泡變性-(7/7)+(4/4)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)-(7/7)-(3/4)++(1/4)心肌壞死+(1/4)

2.2 多柔比星對(duì)食蟹猴血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平的影響 給予食蟹猴注射多柔比星4周后，血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平與對(duì)照組相比升高，分別是對(duì)照組的3.1、10.67、3.47倍，且兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 多柔比星處理4周后食蟹猴血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP濃度的變化(pg/L)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 多柔比星對(duì)食蟹猴血漿中miR-1-3p表達(dá)水平的影響 食蟹猴外周血血漿和心臟組織中miR-1-3p的表達(dá)水平在給藥4周后均顯著升高，分別是對(duì)照組的532.8%和237.5%，其表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組食蟹猴外周血漿和心臟組織中miR1相對(duì)表達(dá)水平

2.4 食蟹猴血漿中miR-1-3p的表達(dá)水平與CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相關(guān)性 通過(guò)對(duì)食蟹猴外周血漿中miR-1-3p的ΔCt值與cTnI、CK-MB和NT-proBNP的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，藥物致食蟹猴心臟損傷模型中，外周血漿中cTnI、CK-MB、NT-proBNP和miR-1-3p在給藥4周后，表達(dá)水平均迅速升高，并具有明顯相關(guān)性。見(jiàn)表3。

表3 血漿中miR1的ΔCt值與CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相關(guān)性分析

3 討論

藥物引起潛在的心臟毒性已引起世界各國(guó)藥品監(jiān)管部門、制藥企業(yè)和臨床醫(yī)生的高度關(guān)注。目前因藥物引起心臟毒性損傷而撤市和停止使用及導(dǎo)致患者死亡的概率，已經(jīng)超越肝、腎毒性引起的臟器損傷，據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部藥物不良反應(yīng)監(jiān)察中心推算結(jié)果顯示，中國(guó)因藥物不良反應(yīng)相關(guān)疾病而入院的患者中，因心臟毒性造成的死亡率為5.16%。蒽環(huán)類抗生素是臨床廣泛應(yīng)用的藥物之一，其可引起不可逆心臟毒性，目前主要通過(guò)心臟功能指標(biāo)進(jìn)行心臟毒性的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)，尚無(wú)明確的早期血清學(xué)指標(biāo)。

藥物引起心臟毒性可能與氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)、氧自由基引起的心肌損傷機(jī)制有關(guān)，目前比較成熟的標(biāo)志物包括血漿酶學(xué)標(biāo)志物(CK-MB等)、炎性反應(yīng)標(biāo)志物(CRP等)、心肌缺血壞死標(biāo)志物(cTnT等)，有的敏感性較好而特異性欠佳，有的釋放早，但出現(xiàn)的窗口期短。近年研究表明，miR-1在急性心肌梗死早期階段表達(dá)升高，且與CK-MB等指標(biāo)趨勢(shì)一致[15]，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3是miR-1調(diào)控的一個(gè)靶點(diǎn)[16]。食蟹猴是各項(xiàng)指標(biāo)最接近人體的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，但有關(guān)miR在藥物所致心臟毒性損傷的食蟹猴外周血中的表達(dá)水平尚未見(jiàn)報(bào)道。

cTnI、CK-MB、NT-proBNP濃度均具有高度的心肌特異性[17]，在心肌受損的情況下逸出而導(dǎo)致血漿中濃度增高，是心肌損傷最特異和敏感的標(biāo)志物之一，目前已較廣泛應(yīng)用于臨床診斷。本研究觀察了食蟹猴給藥發(fā)生心肌損傷后血漿中cTnI、CK-MB和NT-proBNP蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心肌受損第4周，血漿中CK-MB、cTnI和NT-proBNP的含量均明顯升高，驗(yàn)證了cTnI、CK-MB和NT-proBNP可作為藥物致心臟損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。

Kuwabara等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，在不穩(wěn)定型心絞痛患者的血漿中，miR-1的升高主要源于損傷的心肌細(xì)胞，且其表達(dá)水平上調(diào)與心肌的缺血應(yīng)激相關(guān)，miR-1在缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制中起重要作用。本研究采用Real-time PCR法，測(cè)定給藥4周后食蟹猴外周血漿中miR-1-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組miR-1-3p的水平是對(duì)照組的532.8%，并推測(cè)血漿miR-1-3p表達(dá)水平升高的機(jī)制與缺血心肌細(xì)胞釋放增加有關(guān)，心臟組織中miR-1-3p升高為對(duì)照組的237.5%，結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果，提示miR-1-3p有可能作為診斷和預(yù)測(cè)藥物引起心肌損傷的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，食蟹猴心肌損傷模型中，其外周血漿中的miR-1-3p表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且血漿中miR-1-3p表達(dá)水平的變化與cTnI、CK-MB和NT-proBNP呈顯著正相關(guān)，提示miR-1-3p在血漿中表達(dá)水平的變化有可能作為藥物引起心肌損傷的分子標(biāo)志物或聯(lián)合檢測(cè)標(biāo)志物；且由于Real-time PCR法測(cè)定miR-1-3p簡(jiǎn)單易行，血漿無(wú)須特殊處理，有較好的臨床應(yīng)用前景。但該指標(biāo)存在檢測(cè)費(fèi)用較高等問(wèn)題，而且作為生物標(biāo)志物，miR-1-3p評(píng)價(jià)藥物引起心臟損傷的作用是否更優(yōu)于現(xiàn)有的生物標(biāo)志物如pro-BNP等，以及其在藥物引起心臟毒性損傷過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不完全明確，這些都有待進(jìn)一步研究的證實(shí)和大量數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。