宋國(guó)濱，王 剛，黃 穎，徐元宏

肺炎克雷伯菌由于最近幾年對(duì)臨床常用抗生素的耐藥率呈現(xiàn)大幅度增長(zhǎng)，已經(jīng)躍居為院內(nèi)感染的第二大致病菌，引起臨床醫(yī)師、臨床微生物實(shí)驗(yàn)室醫(yī)務(wù)工作者的高度重視[1]。除耐藥率越來(lái)越高的特點(diǎn)外，其毒力基因同樣受到廣大醫(yī)務(wù)工作者及科研工作者的關(guān)注，從1986年，Liu et al[2]報(bào)道了肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的原發(fā)性侵襲性肝膿腫，伴有轉(zhuǎn)移性眼內(nèi)炎病例以來(lái)，越來(lái)越多的病例在國(guó)內(nèi)外很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)都有報(bào)道，因其具有高毒力性、高致病性，有學(xué)者[3]將其稱為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有豐富的莢膜多糖導(dǎo)致菌落呈現(xiàn)高黏液表型，可以抵抗中性粒細(xì)胞對(duì)其的殺傷作用，并可借助中性粒細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，引起眼部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[4]。尤其肺炎克雷伯菌引起的血流感染，導(dǎo)致的敗血癥極易增加患者的住院時(shí)間，引起患者的死亡。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)及其相關(guān)序列(CRISPR associated sequences, CAS)組成的CRISPR-CAS系統(tǒng)廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中，是近30年發(fā)現(xiàn)的天然的適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)[5]。該研究著重探討分離于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血流感染陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌的莢膜血清型、毒力相關(guān)基因的分布情況，以及與CRISPR-CAS系統(tǒng)的相關(guān)性，以便更好地闡明兩者之間的關(guān)系，有助于為臨床防控感染以及研究毒力基因的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及鑒定收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2018年1月～2019年1月保存的血流感染陽(yáng)性非重復(fù)肺炎克雷伯菌，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)重新鑒定，質(zhì)譜鑒定質(zhì)控菌株大腸埃希菌8739及實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2 儀器與試劑高速冷凍離心機(jī)(中國(guó)heal force公司)；GeneAmp970基因擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)；C-880V CO2孵箱、紫外線凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；VITEK MS質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃公司)?？咕幬?英國(guó)OXOID公司)；瓊脂糖、引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；標(biāo)志物DNA Marker、Premix TaqTM(日本TaKaRa公司)；VITEK MS CHCA基質(zhì)液(法國(guó)生物梅里埃公司)；哥倫比亞血平板(合肥天達(dá)診斷試劑有限公司)；藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基為Muller-Hinton瓊脂(江門市凱林貿(mào)易有限公司)。

1.3 藥物敏感試驗(yàn)采用vitek-compact2儀器及紙片擴(kuò)散法對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 高黏液表型篩選將菌株復(fù)蘇接種于血平板上，在培養(yǎng)箱孵育22 h后，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，拉絲實(shí)驗(yàn)的黏液絲≥5 mm為陽(yáng)性[6]。

1.5 PCR檢測(cè)莢膜血清型、毒力基因?qū)⒕杲臃N于哥倫比亞血平板上，置于37 ℃溫箱中孵育18～22 h，挑取4～5個(gè)單菌落置于500 μl TE緩沖液內(nèi)，在振蕩器上渦旋震蕩10 s，放于水浴鍋內(nèi)煮10 min后冰上冷卻5 min，12 000 r/min離心10 min，離心后吸取300 μl上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，即為DNA模板。運(yùn)用PCR擴(kuò)增K1、K2、K5、K20、K54、K57 6種最常見(jiàn)莢膜血清型和rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH 7種毒力相關(guān)基因。其條件為94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性60 s，50～59 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸10 min。引物序列參考文獻(xiàn)[7-10]、退火溫度及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

1.6 PCR檢測(cè)CRISPR-CAS系統(tǒng)根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]分別擴(kuò)增CRISPR-1、CRISPR-2、CAS1 3種基因，退火溫度進(jìn)行梯度摸索，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于網(wǎng)站http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr進(jìn)行比對(duì)，CAS1陽(yáng)性及CRISPR-1、CRISPR-2兩個(gè)基因中至少一個(gè)基因陽(yáng)性代表存在CRISPR-CAS系統(tǒng)，其余基因陽(yáng)性組合為不存在CRISPR-CAS系統(tǒng)。

表1 6種莢膜血清型和7種毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性紙片擴(kuò)散法和vitek-compact2儀器結(jié)果一致。將61株肺炎克雷伯菌分為hvKP和經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)2種類型,hvKP對(duì)氨芐西林天然耐藥，對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、亞胺培南、美羅培南、替加環(huán)素、多黏菌素B均敏感。cKP對(duì)氨芐西林均耐藥，對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、亞胺培南、美羅培南、替加環(huán)素、多黏菌素B的耐藥率分別為48.8%、56.1%、61%、65.9%、63.4%、58.5%、44%、46.3%、41.4%、2.4%、14.6%。

2.2 肺炎克雷伯菌拉絲實(shí)驗(yàn)61株肺炎克雷伯菌經(jīng)過(guò)拉絲實(shí)驗(yàn)共檢出14株陽(yáng)性菌，檢出率為23%，經(jīng)PCR檢測(cè)14株高黏液型菌株rmpA基因全為陽(yáng)性，定義為hvKP,其余為cKP。

2.3 莢膜血清型及毒力基因分布情況PCR檢出K1型12株，K2型8株，K5、K20、K57各1株。毒力基因以fimH檢出最多，為60株，檢出率為98.4%，rmpA、aerobactin、alls、Kfu、wcaG、magA分別檢出20、14、6、19、12、12株，檢出率分別為是32.8%、23.0%、9.8%、31.1%、19.7%、19.7%。hvKP與cKP莢膜血清型及毒力基因分布情況見(jiàn)表2，5種莢膜血清型陽(yáng)性條帶圖見(jiàn)圖1，7種毒力基因條帶圖見(jiàn)圖2。

表2 hvKP與cKP莢膜血清型及毒力基因分布情況[n(%)]

圖1 5種莢膜血清型陽(yáng)性條帶圖

M:Marker;1、2:K1血清型；3、4:K2血清型；5、6：K5血清型；7、8:K20血清型；9、10：K57血清型

2.4 CRISPR-CAS系統(tǒng)與毒力基因分布相關(guān)性經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)及測(cè)序，共篩選出CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株為11株，CRISPR-CAS系統(tǒng)陰性為50株，CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株中，有9株為hvKP，有5株同時(shí)含有rmpA、aerobactn、alls、Kfu、wcaG、magA、fimH。有3株同時(shí)含有rmpA、aerobactin、Kfu。1株只含有rmpA、aerobactin 2種基因。除fimH基因外，CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株其攜帶毒力基因數(shù)量明顯高于CRISPR-CAS系統(tǒng)陰性菌株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CRISPR-CAS系統(tǒng)與毒力基因相關(guān)性見(jiàn)表3。

圖2 7種毒力基因條帶圖

M:Marker;1、2:rmpA基因陽(yáng)性;3、4:wcaG基因陽(yáng)性;5、6:aerobactin基因陽(yáng)性;7、8:Kfu基因陽(yáng)性;9、10:alls基因陽(yáng)性;11、12:magA基因陽(yáng)性;13、14:fimH基因陽(yáng)性

表3 CRISPR-CAS系統(tǒng)與毒力基因相關(guān)性(n)

*采用Fisher確切概率法比較，無(wú)χ2值

3 討論

hvKP因其攜帶多個(gè)毒力基因，使其呈現(xiàn)高黏液表型，可以抵抗人體內(nèi)中性粒細(xì)胞的殺傷作用，極易引起敗血癥，給患者的健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。hvKP除了可以引起院內(nèi)感染外，也可引起社區(qū)感染，正常青年人同樣可以感染此種類型菌株，并易向眼部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等位置遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究61株肺炎克雷伯菌共篩選出14株hvKP，其對(duì)抗生素的耐藥性遠(yuǎn)低于普通肺炎克雷伯菌。K1和K2型莢膜血清型在6種血清型中檢出率最高，且最常見(jiàn)、毒力最強(qiáng)[13]，除了在hvKP中檢出到K1型，在cKP中也有檢出到，與李喜紅 等[14]研究一致。rmpA基因是促進(jìn)肺炎克雷伯菌莢膜多糖合成的調(diào)控基因，其編碼的rmpA蛋白可以促進(jìn)高黏液表型的形成。本研究中，除了14株拉絲實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株rmpA基因陽(yáng)性，在拉絲實(shí)驗(yàn)陰性的菌株中也檢測(cè)到了rmpA基因，說(shuō)明高黏液表型的形成除了rmpA基因參與調(diào)控外，還需要其他毒力基因共同參與。對(duì)于很多生物來(lái)講，鐵作為一種輔助因子在生化代謝方面，電子傳遞等生命活動(dòng)過(guò)程中起到非常重要的作用，aerobactin基因所編碼產(chǎn)生的鐵載體，可以競(jìng)爭(zhēng)血液中的鐵離子，促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)繁殖，是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，有研究[15]表明，aerobactin存在可以使菌株的毒力增強(qiáng)100倍，本研究該基因僅存在于14株hvKP中，從側(cè)面可以反映出菌株高黏液表型的形成與aerobactin基因的存在密切相關(guān)。值得注意的是，本研究中毒力基因fimH基因篩選數(shù)量最多，與付方俊 等[16]的研究一致，在hvKP和cKP中并沒(méi)有顯著區(qū)別，說(shuō)明該基因并不能成為區(qū)分肺炎克雷伯菌的一個(gè)標(biāo)志。magA基因編碼的蛋白可以促進(jìn)黏液性的形成，并參與莢膜多糖的產(chǎn)生，后來(lái)的研究[17]證實(shí)該基因僅存在于血清型K1菌株中，本研究結(jié)果與之一致，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)的報(bào)道[18]。wcaG基因的編碼產(chǎn)物為胞外多糖的巖藻糖，可以避免被血液中巨噬細(xì)胞的吞噬作用所消滅，本研究中該基因也和K1型血清型分布一致，可能和K1血清型基因分布在同一質(zhì)粒上，是否含有其他的機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。其他毒力基因在hvKP中的檢出率明顯高于cKP。

CRISPR-CAS系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其間隔序列與噬菌體和質(zhì)粒有很高的同源性，有學(xué)者[8]認(rèn)為該系統(tǒng)可以抵御來(lái)源于外界的核酸，經(jīng)過(guò)一系列研究，證實(shí)了該系統(tǒng)可以對(duì)外源核酸進(jìn)行切割，具體的過(guò)程分為3步：首先在適應(yīng)性階段，攜帶一個(gè)或多個(gè)CRISPR基因座的細(xì)菌和古生菌通過(guò)將外源序列的短片段(原間隔子)整合到宿主染色體CRISPR序列近端對(duì)外源病毒和質(zhì)粒作出反應(yīng)，在表達(dá)和干擾階段，重復(fù)間隔子元件轉(zhuǎn)錄到為前體CRISPR-RNA(pre-crRNA)分子，然后經(jīng)過(guò)酶切產(chǎn)生短的crRNA，可與入侵病毒或質(zhì)粒的互補(bǔ)原間隔子序列配對(duì),由crRNA識(shí)別目標(biāo)并通過(guò)與crRNA結(jié)合的CAS蛋白來(lái)使外源核酸序列不表達(dá)達(dá)到清除外源核酸的目的。肺炎克雷伯菌的毒力基因存在于質(zhì)粒中，有很多文獻(xiàn)研究過(guò)其與耐藥性之間的相關(guān)性，而與毒力基因之間存在的相關(guān)性研究不多，本研究將61株肺炎克雷伯菌分為CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株和CRISPR-CAS系統(tǒng)陰性菌株，顯示CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株毒力基因攜帶率比CRISPR-CAS系統(tǒng)陰性菌株高，經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其與質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的耐藥基因的攜帶率正好相反，本研究中，hvKP除了對(duì)氨芐西林天然耐藥外，對(duì)臨床常用抗生素均有良好的敏感性，cKP對(duì)抗生素的耐藥率較高，可能和由質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶的傳播有關(guān)，其具體的耐藥機(jī)制還應(yīng)通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)從分子基因水平進(jìn)行驗(yàn)證，另外在細(xì)菌的進(jìn)化過(guò)程中，耐藥基因的獲得對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起到非常重要的作用，但并不是任何的質(zhì)粒都能被細(xì)菌所接受，仍然需要平衡細(xì)菌獲得質(zhì)粒所需能量與細(xì)菌所產(chǎn)能量之間兩者的關(guān)系。Palmer et al[19]的研究表明，CRISPR-CAS系統(tǒng)陽(yáng)性菌株其耐藥率比陰性系統(tǒng)低，本研究通過(guò)χ2檢驗(yàn)經(jīng)過(guò)計(jì)算CRISPR-CAS系統(tǒng)與耐藥性之間的相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本數(shù)量少有關(guān)，對(duì)于質(zhì)粒介導(dǎo)的毒力基因和CRISPR-CAS系統(tǒng)相關(guān)性的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。