李 雪，王 悅，張 揚，蔡海峰，馮福民，張美航，吳冬雪，王 雪，張 咪，朱晗瑀，陳 琦，楊 帆

乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起以肝臟急性或慢性炎性損傷為主的傳染病。HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝癌的危險因素[1]。因此，動態(tài)監(jiān)控乙肝患者不同階段肝指標(biāo)的損傷情況，可以使患者更早的得到治療。目前臨床上多采用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)作為肝損傷的檢測指標(biāo)，在肝損傷診斷、治療效果評價中具有重要作用，但其特異性較差。miRNAs[1]作為非編碼RNA的一種，越來越受到研究者的關(guān)注。李玉紅 等[2]發(fā)現(xiàn)miR-122可通過調(diào)控其下游靶基因從而導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生。Luna et al[3]發(fā)現(xiàn)在HBV感染患者中血清miR-122的表達(dá)增加，且與肝臟損傷程度密切相關(guān)。因此，研究人員推測miR-122可能參與了乙肝的發(fā)生發(fā)展。miR-155與乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，研究[4]表明miR-155在調(diào)節(jié)炎癥-腫瘤過程中具有重要作用。

現(xiàn)對乙肝患者血漿miR-122、miR-155進(jìn)行實時監(jiān)測，分析其與ALT、AST及相關(guān)因子的關(guān)系，為臨床上早發(fā)現(xiàn)和治療HBV導(dǎo)致的肝損傷提供新思路[3]。

1 材料與方法

1.1 病例資料2015年9月～2016年9月在唐山市第四醫(yī)院住院的乙肝患者共86例作為研究對象，體檢健康者共101例作為對照組，且民族均為漢族。研究對象均簽訂知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：對照組為ALT、AST正常的健康體檢者，乙肝組均符合乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS299-2008)；年齡18～72(5.12±2.35)歲[1]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：除HBV外的其他病毒感染者；孕產(chǎn)婦；合并其他肝病的患者；服用引起肝功異常藥物者；有惡性腫瘤、血液病者；近1個月內(nèi)有輸血史者[1]。

1.2 問卷調(diào)查收集乙肝組及對照組的基礎(chǔ)資料、抗病毒治療方案、個人病史及用藥史。

1.3 血液標(biāo)本的收集與處理連續(xù)收集研究對象5次血樣本，即入院后治療前的第1份靜脈血，治療1、2、3、4周的靜脈血；離心取上清液于EP管中，-80 ℃ 保存。

1.4 血漿中相關(guān)非編碼RNA檢測

1.4.1引物序列 在Pubmed上搜索出各基因的完整序列；引物的設(shè)計及合成均來自生工生物工程(上海)股份有限公司。見表1。

表1 擴(kuò)增基因及引物序列

1.4.2qRT-PCR檢測miR-122、miR-155的mRNA表達(dá)水平 TRIzol法提取血漿總RNA，測其濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt計算結(jié)果。

1.5 ELISA法檢測血漿中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、p53、CyclinD1等因子的含量試劑盒室溫平衡20 min后取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品各50 μl，樣本孔加血清10 μl同時加入40 μl樣本稀釋液，各孔加入辣根過氧化物酶，封板膜封住，37 ℃溫育后，洗板5次，每孔加入底物A、B，37 ℃溫育后，加終止液，酶標(biāo)儀選擇波長450 nm處檢測吸光度值(optical density,OD)值，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算蛋白含量。ELISA溫育過程不要貪快，要充分溫育。試劑盒購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司(批號：201611)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一般因素采用χ2檢驗，計量資料采用進(jìn)行統(tǒng)計描述，檢測方差齊性，方差齊時，組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析，兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義[4]。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況兩組間在性別、年齡、文化程度、吸煙、飲酒等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組具有可比性。見表2。

2.2 miR-RNA及其相關(guān)因子在對照組中的可信區(qū)間SPSS軟件對健康對照者血漿中miR-122、miR-155、IL-6、TNF-α、p53及CyclinD1的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計描述，為實驗組各指標(biāo)的表達(dá)水平提供參考，見表3。

2.3 miR-RNA及其相關(guān)因子在乙肝患者血漿中的動態(tài)變化情況結(jié)果顯示，miR-122、miR-155在乙型肝炎患者血漿中均存在異常表達(dá)。對乙肝組86例患者血漿進(jìn)行5個時間點動態(tài)監(jiān)測，檢測時點為0(入院第1份血液標(biāo)本)、1、2、3、4周，每組樣本量分別為86、86、86、11、7例。結(jié)果表明miR-122表達(dá)在治療第2周時表達(dá)量出現(xiàn)高峰，而在治療第3、4周時表達(dá)水平逐漸降低；miR-155的表達(dá)則隨著治療周期的延長逐漸降低，并且與剛?cè)朐簳r相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 乙肝患者血漿各個時點miR-122、miR-155動態(tài)變化

表2 乙肝組和健康對照組一般情況分布[n(%)]

一般因素乙肝組(n=86)健康對照組(n=101)χ2值P值性別5.780.13 男63(73.2)65(64.4) 女23(26.8)36(35.6)年齡(歲)1.700.21 18～3012(13.0)20(19.8) >30～4533(35.6)48(47.5) >45～6037(40.0)32(31.7) >60～72 4(4.4) 1(1.0)文化程度0.170.94 小學(xué)及以下16(18.6)17(16.8) 初中31(36.0)39(38.6) 高中及以上39(45.4)45(44.6)吸煙0.040.89 吸煙49(57.0)59(58.4) 不吸煙37(43.0)42(41.6)飲酒1.900.18 飲酒57(66.2)57(56.4) 不飲酒29(33.8)44(43.6)

表3 miR-RNA及其相關(guān)因子在健康對照者血漿中的表達(dá)

IL-6、TNF-α、Cyclin D1表達(dá)隨著治療周期的延長逐漸下降，并且與剛?cè)朐合啾炔町惥薪y(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。p53的表達(dá)水平隨著治療周期的延長則呈現(xiàn)上升趨勢，與剛?cè)朐簳r相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 乙肝患者血漿各個時點IL-6、TNF-α動態(tài)變化

2.4 miR-RNA與肝功指標(biāo)及相關(guān)因子的相關(guān)性結(jié)果顯示，miR-122、miR-155與ALT、AST、IL-6、TNF-α、CyclinD1等均呈正相關(guān)，miR-122與p53呈正相關(guān)，但miR-155與p53呈負(fù)相關(guān)；且miR-122、miR-155均與ALT的相關(guān)系數(shù)較大。見表4。

3 討論

中國甲乙類法定報告?zhèn)魅静≈?，乙型肝炎的發(fā)病率和死亡率均位列前三，不容小覷。因此，對乙型肝炎病程及其肝損傷的程度進(jìn)行有效監(jiān)測，找到靈敏的監(jiān)測指標(biāo)對乙肝的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

圖3 乙肝患者血漿各個時點p53、CyclinD1動態(tài)變化

表4 血漿miR-122、miR-155與ALT、AST及相關(guān)因子的相關(guān)性分析

指標(biāo)統(tǒng)計值miR-122miR-155ALTr值0.490.60P值<0.01<0.01ASTr值0.470.56P值<0.01<0.01IL-6r值0.210.65P值<0.01<0.01TNF-αr值0.190.62P值<0.01<0.01p53r值0.16-0.28P值<0.01<0.01CyclinD1r值0.120.65P值<0.01<0.01

近年來，研究[5-6]表明miRNA在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。裴麗玲 等[7]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者血清miR-451a的表達(dá)明顯低于對照組，提示其與肝癌的遷移和惡性程度密切相關(guān)，在肝細(xì)胞癌診斷、治療及預(yù)后方面具有較高的臨床應(yīng)用價值。孟凡龍 等[8]研究表明miR-106b在肝癌患者血清中表達(dá)量顯著升高，可作為潛在生物標(biāo)志。以上研究表明miR-RNA與肝病密切相關(guān)，該研究在乙型肝炎患者入院治療前及治療1、2、3、4周5個時點對血漿中miR-122、miR-155表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明miR-122、miR-155的表達(dá)與剛?cè)朐簳r相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-122、miR-155可能參與了乙型肝炎的發(fā)展過程。

有研究[9-11]顯示miRNAs參與生命過程中的各種調(diào)節(jié)途徑，包括細(xì)胞增殖和凋亡等。TNF-α作為重要的炎癥介質(zhì)，IL-6作為多功能細(xì)胞因子，其聯(lián)合起來可作為反映機(jī)體炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。而ALT、AST等又是臨床上反映肝臟損傷程度的重要指標(biāo)，因此該研究通過分析miR-122、miR-155與ALT、AST及其相關(guān)因子的相關(guān)性，探討miR-122、miR-155對乙肝患者的作用意義及可能的作用方式。結(jié)果顯示，乙肝患者血漿中miR-122、miR-155的異常表達(dá)與乙型病毒性肝炎引起的肝損傷有關(guān)，并可能參與了乙肝的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)控。