完顏智翔，王極宇，潘 瑩，朱鳳鳳，易瀏穎，翟志敏

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人淋巴瘤最常見的一種類型，是一組在臨床表現(xiàn)和預(yù)后等方面具有高度異質(zhì)性的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。自由環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松組成的標(biāo)準(zhǔn)化療方案被用于治療DLBCL 以來，完全緩解率達(dá)60%～70%[2]。聯(lián)合利妥昔單抗進一步提高了療效，但仍有30%～40%左右的患者復(fù)發(fā)并最終死亡[3]。SENEX 最早在2004 年被認(rèn)定克隆成功，是一個與細(xì)胞衰老密切相關(guān)的新型基因[4]，主要控制細(xì)胞的生長周期、衰老和凋亡[5-6]。最早在2010年，有學(xué)者[4]首次報道了關(guān)于SENEX基因通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中p16INK4a 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)力性早衰形成的研究。但其在DLBCL中的表達(dá)及作用目前尚未見相關(guān)報道。該研究擬探討SENEX基因在DLBCL中的表達(dá)及其對DLBCL復(fù)發(fā)的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人DLBCL細(xì)胞株(LY8)購自上海細(xì)胞所；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；SENEX-SiRNA及其陰性對照(negative control,NC)購自上海生工公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋華科生物科技公司；細(xì)胞裂解液購自上海碧云天公司；PVDF膜購自美國millipore公司；High-sig ECL Western Blotting Substrate試劑盒購自上海天能公司；人與腺病毒E2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor binding to the adenovirus E2 promoter，E2F)1轉(zhuǎn)錄因子ELISA試劑盒購自美國OmnimAbs公司；Cell Counting Kit-8購自日本Dojindo公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermofisher公司；TB Green PCR試劑盒購自日本Takara公司。Western blot抗體購自美國Cell Signaling technology公司，見表1。PCR 引物均由上海生工生物有限公司合成，見表2。

1.2 方法

1.2.1病例資料 選擇2019年2～7月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)確診的DLBCL患者，其中DLBCL初診患者3例，男1例，女2例，年齡分別為：51、67、68歲；獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)緩解的DLBCL患者3例，男2例，女1例，年齡分別為：52、56、70歲；緩解后復(fù)發(fā)的DLBCL患者3例，男2例，女1例，年齡分別為：47、50、65歲。所有緩解及復(fù)發(fā)的DLBCL患者均為骨髓緩解及復(fù)發(fā)。

1.2.2外周血單個核細(xì)胞分離 收集患者外周血5 ml，經(jīng)等體積生理鹽水稀釋后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中，離心，收集中間白膜狀細(xì)胞層，經(jīng)生理鹽水洗滌后，離心去除上清液，留取細(xì)胞沉淀，待用。

表2 用于qRT-PCR引物和SiRNA轉(zhuǎn)染的序列

1.2.3Western blot檢測 使用人外周血淋巴細(xì)胞分離液提取患者外周血中的單個核細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液分別提取外周血單個核細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后LY8細(xì)胞中的總蛋白。通過凝膠電泳分離蛋白，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入溶于TBST的5%脫脂牛奶中封閉，4 ℃條件下相應(yīng)一抗孵育過夜，二抗(1 ∶ 5 000)室溫孵育1 h后顯影。

1.2.4qRT-PCR檢測 使用適量TRIzol分別提取外周血單個核細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后LY8細(xì)胞中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。通過使用TB Green PCR試劑盒在熒光定量PCR儀上進行qPCR實驗。所有引物均由上海生工合成。磷酸甘油醛脫氫酶用作內(nèi)參基因。使用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5SiRNA轉(zhuǎn)染實驗 將LY8細(xì)胞接種至6孔板中，并更換為無血清培養(yǎng)基。分別將opti-MEM與SENEX-SiRNA/NC和Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑混勻后孵育5 min，再分別將兩者混合室溫孵育20 min后加入6孔板中，37 ℃培養(yǎng)。4 h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h，驗證其轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6細(xì)胞增殖實驗 將已成功轉(zhuǎn)染SENEX-SiRNA/NC的LY8細(xì)胞，按105個細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后上機檢測450 nm各孔的吸光度(optical density，OD)值。同時設(shè)置空白孔、對照孔，且每組設(shè)立5個復(fù)孔。

1.2.7ELISA檢測 將已成功轉(zhuǎn)染SENEX-SiRNA/NC的LY8細(xì)胞，通過離心除去沉淀留取上清液，將樣品儲存在-20 ℃避免反復(fù)凍融。使用ELISA試劑盒測量轉(zhuǎn)錄因子E2F的濃度。使用原溶液(8 000 pg/ml)配置2倍稀釋梯度(包括4 000、2 000、1 000、500、250 pg/ml)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品一式兩份加入包被板中，并將空白孔作為零，在添加終止溶液后15 min內(nèi)測量450 nm處的OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的兩組間數(shù)據(jù)比較均采用t檢驗方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SENEX基因在初診、復(fù)發(fā)與緩解DLBCL患者中的表達(dá)情況為研究DLBCL患者中SENEX的表達(dá)水平，課題組分別提取了初診、復(fù)發(fā)和完全緩解DLBCL患者外周血中的單個核細(xì)胞，并檢測了細(xì)胞中SENEX基因及其編碼蛋白ARHGAP18的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。與初診組和完全緩解組相比，復(fù)發(fā)組ARHGAP18蛋白表達(dá)水平增高(F=148.0，P<0.01)(圖1C)，與此結(jié)果一致的是，SENEX基因水平也升高(F=10.60，P<0.01)(圖1A)。此外，外周血磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(phosphorylation retinoblastoma, pRb)水平在復(fù)發(fā)患者中升高，完全緩解患者中降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.21，P<0.01)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma, Rb)表達(dá)水平則顯示出相反的趨勢(F=10.69，P<0.05)(圖1B、C)。這些結(jié)果表明復(fù)發(fā)DLBCL患者的SENEX水平增加并伴隨著Rb途徑的激活。

2.2 LY8細(xì)胞中SENEX-SiRNA的轉(zhuǎn)染與驗證為了研究SENEX基因在人DLBCL細(xì)胞株LY8中的功能，將靶向SENEX基因的SiRNA(SENEX-SiRNA)及其陰性對照(negative control, NC)轉(zhuǎn)染至LY8細(xì)胞中，并從基因水平和蛋白水平驗證其轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果如圖2所示，與對照組(未經(jīng)任何處理的LY8細(xì)胞)和NC組(圖2A)相比，SENEX-SiRNA組中SENEX mRNA的表達(dá)降低(F=104.3，P<0.01)，并且SENEX-SiRNA組中ARHGAP18的水平也低于對照組和NC組(F=19.06，P<0.01)(圖2B)。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SENEX-SiRNA成功沉默了DLBCL細(xì)胞中的SENEX基因表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，課題組繼續(xù)研究了干預(yù)SENEX表達(dá)對DLBCL細(xì)胞功能和相關(guān)通路的影響。

圖1 SENEX基因在初診、復(fù)發(fā)與緩解DLBCL患者中的表達(dá)情況

A：qRT-PCR方法檢測SENEX基因表達(dá)結(jié)果；B：Western blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果；C：pRb、Rb和ARHGAP18的相對表達(dá)量；與初診組和完全緩解組比較：**P<0.01，*P<0.05;與初診組和復(fù)發(fā)組比較：△△P<0.01

圖2 3組細(xì)胞中SENEX基因mRNA和ARHGAP18表達(dá)情況

A：SENEX基因mRNA在3組細(xì)胞中的表達(dá)；B：ARHGAP18在3組細(xì)胞中的表達(dá)；與對照組和NC組比較：**P<0.01

2.3 干預(yù)SENEX基因表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響在轉(zhuǎn)染后12 h比較各組細(xì)胞增殖能力的差異，結(jié)果如圖3所示。與對照組和轉(zhuǎn)染NC組相比，轉(zhuǎn)染SENEX-SiRNA組細(xì)胞增殖能力減低(F=16.38，P<0.01)(圖3A)，在轉(zhuǎn)染后24 h，SENEX-SiRNA組細(xì)胞增殖能力繼續(xù)降低，與對照組和NC組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.575，P<0.01；t=2.705，P<0.05)(圖3B)。結(jié)果表明，沉默DLBCL細(xì)胞中的SENEX基因表達(dá)將抑制細(xì)胞增殖。

2.4 干預(yù)SENEX基因表達(dá)對Rb/E2F通路的影響為了進一步探究SENEX基因促進DLBCL細(xì)胞增殖的分子機制，課題組分析了細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子，顯示與對照組和NC組相比，SENEX-SiRNA組中pRb水平降低(F=53.54，P<0.01)(圖4A);與NC組相比，SENEX-SiRNA組中游離的E2F1濃度出現(xiàn)降低(t=4.526,P<0.05)(圖4B)。這些結(jié)果表明SENEX基因能夠促進Rb蛋白和E2F1活化，提示了SENEX基因具有活化細(xì)胞周期開關(guān)—Rb/E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路的能力。

圖3 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率

A：轉(zhuǎn)染12 h細(xì)胞增殖率；B：轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞增殖率；與對照組和NC組比較：△△P<0.01；與NC組比較：*P<0.05；與對照組比較：##P<0.01

3 討論

近年來，細(xì)胞免疫治療的興起特別是CAR-T技術(shù)的應(yīng)用為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療帶來了重要突破，尤其是CAR-T-CD19治療復(fù)發(fā)難治急性B淋巴細(xì)胞白血病獲得了高達(dá)80%～90%的完全緩解率，但是在DLBCL 等B細(xì)胞淋巴瘤中CAR-T治療并未獲得類似滿意療效，反應(yīng)率僅在50%左右，有研究[7]認(rèn)為這與淋巴瘤復(fù)雜的免疫逃逸機制有關(guān)。SENEX基因是一種與細(xì)胞衰老相關(guān)的新型基因，已被證明在心臟、肺、骨骼肌、腎、胰腺、脾臟、腦、睪丸組織和外周血白細(xì)胞中都有不同程度表達(dá)，主要控制細(xì)胞的生長周期、衰老和凋亡，也有研究[4-6,8]稱其參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。課題組之前的研究[9]表明，SENEX增加會引起促凋亡基因表達(dá)減少，細(xì)胞因子合成受到干擾，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，從而促進膀胱癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移；后又在急性髓細(xì)胞白血病患者中發(fā)現(xiàn)SENEX 基因異常表達(dá)且與與骨髓原始細(xì)胞的負(fù)荷密切相關(guān)[10]。但是在DLBCL中SENEX基因的表達(dá)及作用目前尚未見相關(guān)報道。本研究顯示SENEX基因(及其編碼蛋白ARHGAP18)在復(fù)發(fā)DLBCL患者外周血中表達(dá)較初診組升高，且當(dāng)患者達(dá)到完全緩解時，SENEX基因和蛋白表達(dá)水平均降低。這個結(jié)果提示SENEX基因水平與DLBCL復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，需要在細(xì)胞水平進一步探索SENEX的功能。當(dāng)在人DLBCL細(xì)胞株LY8中沉默SENEX基因表達(dá)后，12、24 h的細(xì)胞增殖活性也出現(xiàn)降低。結(jié)果提示沉默SENEX基因會抑制DLBCL細(xì)胞增殖。

圖4 3組細(xì)胞中Rb的表達(dá)和細(xì)胞因子E2F1的濃度

A：Rb在3組細(xì)胞中的表達(dá)；B：細(xì)胞因子E2F1在3組細(xì)胞中的濃度；與對照組和NC組比較：**P<0.01；與NC組比較：#P<0.05

Rb基因是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，被發(fā)現(xiàn)于兒童的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。研究[11-13]認(rèn)為Rb在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡和生長抑制等方面均具有重要作用。Rb以其磷酸化和去磷酸化的形式?jīng)Q定著轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，在細(xì)胞周期調(diào)控中處于中心環(huán)節(jié)，控制著細(xì)胞的生長和分化，Rb蛋白磷酸化(失活)將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放激活細(xì)胞周期進入S期。磷酸化的Rb解離E2F1，游離的E2F1激活細(xì)胞周期蛋白，并啟動DNA復(fù)制和增殖；而去磷酸化的Rb可以通過募集共抑制因子來抑制E2F的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等方式導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯。有研究[14-15]顯示，通過介導(dǎo)Rb/E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路可能調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在課題組的研究中，復(fù)發(fā)DLBCL患者的pRb水平顯著高于初診組和完全緩解組，但是Rb表達(dá)則呈現(xiàn)相反的趨勢。之后研究了SENEX基因?qū)LBCL細(xì)胞中pRb/Rb表達(dá)的影響，顯示SENEX沉默引起pRb水平降低和游離E2F1的顯著減少。這些結(jié)果表明，SENEX基因誘導(dǎo)的pRb/E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路活化可能在DLBCL的增殖和復(fù)發(fā)中起重要作用。

綜上所述，本研究探討了SENEX基因在DLBCL中的表達(dá)及其對DLBCL復(fù)發(fā)的影響及其可能的作用機制。結(jié)果提示SENEX基因通過活化Rb/E2F1通路促進DLBCL增殖與復(fù)發(fā)?；颊咄庵苎懈咚降腟ENEX表達(dá)可能提示DLBCL復(fù)發(fā)可能，對于臨床預(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。SENEX基因在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的機制研究仍有待深入，未來有望成為治療DLBCL患者尤其是復(fù)發(fā)患者的新靶點。