李淑悅，程 娜，王嘉鑫，肖金平

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題，全世界每年大約有超過78萬人死于乙肝相關(guān)性疾病(如肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌)[1]。HBV病毒感染的特點是感染率高、感染人數(shù)眾多、病程長，目前缺乏特效藥物且難以完全治愈。大面積乙肝疫苗的普及，已經(jīng)使HBV感染率明顯下降[2]，現(xiàn)在人們開始關(guān)注耐藥和徹底清除乙肝病毒問題。近幾十年來，HBV感染的治療藥物主要依賴于干擾素和核苷(酸)類似物(nucleoside/nudeotide analogues，NAs)這兩大類，NAs具有很強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制作用，比基于干擾素的療法更方便并且具有更少的副作用，然而長期用藥后，一些藥物會出現(xiàn)病毒學(xué)突破現(xiàn)象?，F(xiàn)擬使用直接測序法對江西省104例樣本的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(RT區(qū))行耐藥變異位點檢測，區(qū)分基因型、篩選正選擇位點，進(jìn)一步分析該地區(qū)慢性乙肝患者耐藥相關(guān)原因，為患者個體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2015～2018年間在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診定期隨訪的慢性乙型病毒性肝炎患者，共計104例?；颊呔鶃碜越魇”镜貐^(qū)市、縣，所有診斷符合《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[3]。排除HCV、HDV、HIV混合感染，排除酒精性肝病、脂肪肝及自身免疫性肝炎患者。其中男77例，女27例，年齡21～75(43.36±12.47)歲。所有患者均接受了NAs抗病毒治療，療程≥1年?；颊呙?～6個月行血清HBV DNA、肝功能檢測。研究設(shè)計經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核并通過。

1.2 實驗室指標(biāo)實驗室檢測指標(biāo)包括乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、HBV DNA水平。

1.3 應(yīng)答不佳界定抗病毒治療24周，HBV DNA較基線下降幅度>1 log10IU/ml，但仍然可以檢測到[3]。

1.4 HBV DNA RT區(qū)測序根據(jù)HBV DNA P基因RT區(qū)的保守序列，應(yīng)用Primer Premire 5.0軟件自行設(shè)計引物，引物由武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗所合成，序列為：外側(cè)正向引物ESP：5′-AGGCCTTATAAGTTGGCGA-3′，反向引物EAP：5′-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3′；內(nèi)側(cè)正向引物ISP：5′-CY(T/C)TGTATTCCCATCCCATC-3′，反向引物IAP：5′-TGACATACTTTCCAATCA ATAGG-3′，包含大部分目前已知的HBV RT區(qū)核苷酸類似物耐藥變異位點，并利用上述引物構(gòu)建PCR反應(yīng)體系對目的片段擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物由武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗所直接測序。

1.5 基因變異檢測臨床樣本測序結(jié)果以NCBI Genotyping 工具中23株基因型為A-H型的HBV全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參照(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)來確定基因分型。采用BioEdit軟件包(版本7.0.5)進(jìn)行核酸與氨基酸序列的比對，分析氨基酸的變異。

1.6 選擇壓力分析非同義突變和同義突變的率比ω(ω=dN/dS)是反應(yīng)選擇壓力的重要指標(biāo)。當(dāng)ω>1時，表明該位點受到正選擇壓力作用，同時該密碼子被稱為正選擇位點；ω=1或ω<1則分別說明該位點受到中性選擇和純化選擇(即負(fù)選擇)[4]。采用DataMonkey在線軟件(http://www.datamonkey.org/)篩選正選擇位點，Datamonkey由HyPhy執(zhí)行，HyPhy是一種分子進(jìn)化分析平臺，在計算機(jī)集群上進(jìn)行并行分析，簡化且易于使用[5]。Datamonkey篩選正選擇位點的算法主要包括隨機(jī)效應(yīng)似然模型(random effects likelihood model，REL)、固定效應(yīng)似然模型(fixed effects likelihood model，F(xiàn)EL)和單一似然祖先計數(shù)法(single likelihood ancestor counting，SLAC)[6]。SLAC是運行速度最快、同時也是最保守的算法,適用于分析大型數(shù)據(jù)集(50～150條序列)，能夠重建每個密碼子位點的替代過程，存在錯漏選擇位點的可能，但亦能防止將中性位點誤判為正選擇位點。FEL在統(tǒng)計性能和計算工作量之間保持有良好平衡，總體表現(xiàn)屬最佳算法，適用于分析中型或者大型數(shù)據(jù)集(50～100條序列)，也能重建密碼子的替代過程。REL是PAML軟件中基于密碼子進(jìn)行選擇分析這一算法的擴(kuò)展，它允許同義替代率存有差異，因而REL常常是能從小型或者低度分化的序列比對結(jié)果中檢測出選擇作用的唯一方法，適用于小型數(shù)據(jù)集(5～15條序列，至多40條)。然而，由于此法所依賴的假設(shè)條件較多，也容易產(chǎn)生假陽性。從各方法的適應(yīng)條件以及出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果等方面綜合考慮，本研究采用FEL方法篩選正選擇位點(P<0.1)。

2 結(jié)果

2.1 挽救治療的療效分析104例患者中B基因型患者為93例， C基因型患者為11例，未檢測出其他基因型。在兩種不同基因型中性別和年齡方面均無差異(P>0.05)。挽救治療后患者HBV DNA、ALT水平均下降，HBV DNA水平降低更加明顯。但e抗原陰轉(zhuǎn)率、HBV DNA及ALT水平在不同基因型中的無差異(P>0.05)(表1)。

2.2 HBV RT區(qū)主要變異類型及在不同基因型中的分布B基因型和C基因型患者在性別、年齡、耐藥率、HBeAg陽性率、用藥類型方面無差異(表2)。104例患者中87例檢測出與藥物相關(guān)變異位點，其中14例(13.46%)出現(xiàn)多位點耐藥變異(3個及以上位點)；剩余17例中7例未檢出耐藥變異位點。M204I位點變異率最高，以B基因型為主； M204I+L180M位點變異在C基因型中發(fā)生率高于B基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表1 B基因型及C基因型患者的人口學(xué)及臨床特征 [M(P25，P75 )]

表2 B基因型及C基因型患者人口學(xué)及臨床特征

表3 B基因型及C基因型患者耐藥變異類型[n(%)]

2.3 選擇壓力的分析兩種基因型的選擇壓力均以中性選擇為主，但B基因型中可見正選擇位點(表4)。利用在線DataMonkey軟件，以ω值(dN/dS)>1且P<0.1時為正選擇點篩選出B基因型中rt207、rt229 為正選擇位點, rt169、rt245為負(fù)選擇位點；C基因型中只發(fā)現(xiàn)rt202、rt204、rt245為負(fù)選擇位點(表5、6)。

表4 不同基因型的選擇壓力分析(n)

表5 B基因型序列的選擇位點

LRT:似然比檢驗

表6 C基因型序列的選擇位點

3 討論

HBV是一個部分閉合的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，HBV在復(fù)制過程中依賴逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的前基因組RNA完成，而逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性，故是一種具有高變異性的DNA病毒[7-8]。近年來，慢性乙型肝炎的治療取得了實質(zhì)性進(jìn)展，以服用NAs為主，但無限期治療會增加耐藥性發(fā)展的風(fēng)險，在藥物和人體免疫環(huán)境雙重誘導(dǎo)下，HBV RT區(qū)出現(xiàn)了位點突變[9]。目前LAM、LDT出現(xiàn)高耐藥率，慢性乙型肝炎診療指南明確指出可加用ADV,或改用ETV、TDF，隨著各種NAs的廣泛使用，研究[10]表明ETV、ADV、TDF也出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。本研究中104例定期隨訪患者出現(xiàn)耐藥后多選用ETV或TDF進(jìn)行挽救，都表現(xiàn)出良好療效。在不同基因型中，e抗原陰轉(zhuǎn)率、ALT復(fù)常率、e抗原陽性率、耐藥率、用藥類型方面均無差異，但耐藥變異位點A181V+N236T、M204V+L180M+I169T/L+S202G、M204V+L180M+T184A+I169T/L、M204V+L180M+S202G、M204V+L180M+M250L、N236T、S/C256G、S213T、L217F、Q215H、Y/F221H只在B基因型中檢測到,而M204I+A181T、M204V+L180M+T184I+V137、M204V/I+L180M +V137L只在C基因型中檢測到；M204I+L180M位點變異率在C基因型中高于B基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HBV RT區(qū)位點突變是多因素綜合影響的結(jié)果，在臨床工作中基因分型及RT區(qū)測序應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用。

慢性乙肝患者在接受NAs藥物后，來自病毒變異體之間的競爭(復(fù)制效率的差異)和/或宿主免疫活性的選擇壓力，使含有耐藥突變的變異株逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢株，最終導(dǎo)致HBV群耐藥[11-13]。病毒基因突變符合達(dá)爾文進(jìn)化理論——適者生存。對單一的一種抗病毒藥物而言，病毒群體所面臨的就是一個針對特定靶點的具有高度特異性的選擇壓力，當(dāng)一個基因受到正選擇作用，說明其群體為了適應(yīng)新的環(huán)境，需要提供有利的突變，產(chǎn)生新的基因功能；而當(dāng)一個基因受到負(fù)選擇作用即此基因保持原有的功能且趨于穩(wěn)定[14]。正選擇位點篩選是研究病毒基因序列進(jìn)化分析的一個重要方法。RT區(qū)是相對保守區(qū)，以負(fù)選擇作用為主，在本研究中B基因型患者篩選出正選擇位點rt207、rt229，這兩種基因位點并不包含在常見的耐藥位點中，說明江西省內(nèi)核苷酸類似物的廣范使用，促使新的基因功能出現(xiàn)，并亦可能是出現(xiàn)多個新耐藥位點的原因，但這兩個突變位點與哪種藥物耐藥相關(guān)尚未明確，有待進(jìn)一步研究。