秦蘭，劉亭，孫佳，陸苑，潘潔，王永林，李勇軍，林昌虎***，劉春花***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 & 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

玉葉金花為茜草科玉葉金花屬植物玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.)的干燥地上部分，既是我省常用民間藥物，也是苗族常用藥物，苗藥名為“阿崗奴”[1]。玉葉金花具有清熱解毒，祛風(fēng)利濕的功效，可用于感冒、中暑、腸炎、腎炎水腫、咽喉腫痛及支氣管炎等[1-3]。據(jù)《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)和《廣西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)記載，玉葉金花的入藥部位為根和莖，兩“標(biāo)準(zhǔn)”僅對(duì)其形狀進(jìn)行描述、質(zhì)量控制體系較為簡(jiǎn)單僅包含理化鑒別方法，尚不完善[4-5]。民間常用玉葉金花根研粉拌粥服治療小兒疳積，或全株水煎當(dāng)茶飲治療精神分裂癥，也有用鮮葉搗爛調(diào)雞蛋清服用治療斷腸草或野菌中毒[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，玉葉金花含有皂苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)及萜類(lèi)等成分，具有抗炎、抗菌及抗病毒等生物活性及良好的藥用價(jià)值[9-12]。玉葉金花的根、枝、葉或全株均可入藥[1,6]，但至今尚無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限制了應(yīng)用和開(kāi)發(fā)，本研究參照《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定通過(guò)對(duì)玉葉金花的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、檢查及浸出物等項(xiàng)目進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為建立玉葉金花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材與主要試劑 玉葉金花藥材來(lái)自貴州和廣東(表1)，原植物及樣品均由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物與生藥學(xué)教研室張旭副教授鑒定為MussaendapubescensAit.f.的地上部分，憑證標(biāo)本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；玉葉金花對(duì)照藥材(批號(hào)121404-201502)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硫酸、甲醇、乙醇、三氯甲烷及甲酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(均為分析純)，青島海洋硅膠G板購(gòu)自青島海洋化工廠分廠，煙臺(tái)黃海江友硅膠G板購(gòu)自煙臺(tái)黃海江友化工廠，青島鼎康硅膠G板購(gòu)自青島鼎康化工廠。

1.1.2主要儀器 奧林巴斯CX41簡(jiǎn)易偏光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)及明美S60顯微成像系統(tǒng)(廣州明美光電技術(shù)有限公司)，REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)，WP-MP-II-20實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，EL204電子天平(瑞士METTLER公司)，DK-98-Ⅱ型水浴鍋(天津泰斯特有限公司)。

表1 不同批次玉葉金花樣本Tab.1 The different batches of M. pubescens

1.2 方法

1.2.1性狀鑒定 采用標(biāo)尺對(duì)玉葉金花的大小進(jìn)行測(cè)量，采用看、摸、聞及嘗等直觀方法對(duì)樣品的形狀、色澤、表面、質(zhì)地、斷面及氣味進(jìn)行鑒定。

1.2.2顯微鑒別 表面制片系采用表皮撕離法，分別撕取玉葉金花上下表皮，置于載玻片上，滴加甘油醋酸試液，或者加水合氯醛試液加熱透化，再滴加稀甘油，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下(100×)觀察上下表皮細(xì)胞的形狀、氣孔和毛狀體等特征，拍照記錄；粉末制片系挑取玉葉金花粉末(過(guò)4號(hào)篩)少許置載玻片上，滴加蒸餾水、水合氯醛試液或稀甘油試液等(必要時(shí)加熱透化)，蓋上蓋玻片，倒置顯微鏡下(400×)觀察、測(cè)量和拍照。

1.2.3薄層色譜鑒別 取玉葉金花粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.5 g，加乙酸乙酯5 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取玉葉金花對(duì)照藥材0.5 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502進(jìn)行薄層色譜法試驗(yàn)[13]，吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(8.5 ∶1.5 ∶1.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，噴硫酸乙醇溶液置105 ℃加熱10 min，置紫外燈光365 nm檢視。

1.2.4水分、總灰分和浸出物測(cè)定 取玉葉金花粉末(過(guò)2號(hào)篩)2 g，精密稱(chēng)定，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832水分測(cè)定法(第二法 烘干法)進(jìn)行水分測(cè)定[13]；取本品粉末2 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱(chēng)定質(zhì)量(準(zhǔn)確0.01 g)，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2302灰分測(cè)定法進(jìn)行灰分測(cè)定[13]；取本品粉末(過(guò)2號(hào)篩)2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL的錐形瓶中，精密加乙醇50 mL，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201浸出物測(cè)定法中醇溶性浸出物測(cè)定法進(jìn)行浸出物測(cè)定[13]。

2 結(jié)果

2.1 性狀鑒定

玉葉金花莖呈圓柱形，直徑3～10 mm，表面棕色或棕褐色，具細(xì)縱皺紋、點(diǎn)狀皮孔及葉柄痕，質(zhì)堅(jiān)硬、不易折斷，斷面黃白色或淡黃綠色，髓部明顯、白色；葉對(duì)生或輪生、多縮皺、破碎，完整葉片展平后呈卵狀矩圓形、頂端漸尖、基部楔形，上表面近無(wú)毛或被疏毛，下表面密被短柔毛，有時(shí)稍疏；氣微，味淡。見(jiàn)圖1。

圖1 玉葉金花(批號(hào)20170714)藥材的外觀性狀Fig.1 Characters of M. pubescens

2.2 顯微鑒別

玉葉金花藥材的葉表皮顯微結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為：上表皮細(xì)胞呈類(lèi)多角形，垂周壁增厚，氣孔少見(jiàn)；下表皮細(xì)胞不規(guī)則形狀，垂周壁波狀彎曲；氣孔為平軸式；非腺毛多見(jiàn)(圖2)。玉葉金花藥材的粉末顯微結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為：粉末灰白色或灰綠色；非腺毛眾多，由2～9個(gè)細(xì)胞組成，表面光滑，基部直徑10～35 μm；導(dǎo)管主為具緣紋孔，直徑20～90 μm，偶見(jiàn)螺紋導(dǎo)管；石細(xì)胞眾多，長(zhǎng)方形、方形及類(lèi)圓形，直徑15～70 μm；葉上表皮細(xì)胞類(lèi)多角形，葉下表皮細(xì)胞不規(guī)則形狀，垂周壁稍彎曲；纖維壁薄，具單紋孔，直徑12～50 μm(圖3)。

注：A為葉上表皮細(xì)胞，B、C為葉下表皮細(xì)胞。 圖2 玉葉金花的葉表皮顯微結(jié)構(gòu)(100×)Fig.2 Microscopic features of epidermis of leaves of M. pubescens(100×)

注：(1)為葉表皮細(xì)胞，(2)為導(dǎo)管，(3)為石細(xì)胞，(4)為纖維，(5)為非腺毛。圖3 玉葉金花藥材的粉末顯微結(jié)構(gòu)(400×)Fig.3 Microscopic features of powder of M. pubescens(400×)

2.3 薄層色譜

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以玉葉金花對(duì)照藥材作為對(duì)照品對(duì)其進(jìn)行薄層鑒別，結(jié)果顯示在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)分離度良好。見(jiàn)圖4。

注：1為20170230, 2為20170406,3為20180611，4為對(duì)照藥材。圖4 玉葉金花薄層色譜鑒別系統(tǒng)適用性試驗(yàn)Fig.4 Applicability test of the TLC identification system of M. pubescens

2.3.2耐用性試驗(yàn) 不同廠家薄層板展開(kāi)效果顯示，青島海洋、煙臺(tái)江友及青島鼎康3種不同廠家的硅膠G板均能鑒別玉葉金花(圖5)；利用不同濃度硫酸調(diào)整濕度為32%、60%及72%，考察不同濕度條件下的展開(kāi)效果，結(jié)果顯示不同濕度下色譜圖的斑點(diǎn)清晰，均能較好的鑒別玉葉金花(圖6)；分別在10 ℃、20 ℃及30 ℃下展開(kāi)，考察不同溫度對(duì)展開(kāi)的影響，結(jié)果顯示不同溫度下色譜圖的斑點(diǎn)清晰，均能較好的鑒別玉葉金花(圖7)；將同一批次的本品粉末于放置3 d、2 d、1 d及當(dāng)日按擬定的方法制備供試品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開(kāi)顯色結(jié)果顯示，各斑點(diǎn)無(wú)明顯差異(圖8)。

2.3.3不同批次樣品鑒別 按擬定的薄層色譜鑒別方法，對(duì)13批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，13批玉葉金花飲片均符合要求。見(jiàn)圖9。

2.4 水分、總灰分和醇溶性浸出物測(cè)定

13批玉葉金花的水分、總灰分和醇溶性浸出物結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的玉葉金花中水分、總灰分和醇溶性浸出物含量存在一定差異。見(jiàn)表2 。

注：A為青島海洋硅膠板，B為臺(tái)江友硅膠板，C為青島鼎康硅膠板；1為20170230，2為20170406，3為20180611，4為對(duì)照藥材。圖5 玉葉金花在不同廠家硅膠板的展開(kāi)效果Fig.5 Investigation of M. pubescens in silica gel plates from different manufacturers

注：A為相對(duì)濕度32%，B為相對(duì)濕度60%，C為相對(duì)濕度72%；1為20170230，2為20170406，3為20180611，4為對(duì)照藥材。圖6 玉葉金花在不同濕度環(huán)境的展開(kāi)效果Fig.6 Different developing humidity of M. pubescens

注：A為溫度10 ℃，B為溫度20 ℃，C為溫度30 ℃；1為20170230, 2為20170406，3為20180611，4為對(duì)照藥材。圖7 玉葉金花在不同溫度環(huán)境的展開(kāi)效果Fig.7 Different developing temperature of M. pubescens

注：1為當(dāng)日，2為放置1 d，3為放置2 d，4為放置3 d，5為對(duì)照藥材。圖8 玉葉金花供試品溶液穩(wěn)定性考察Fig.8 The stability of the test sample of M. pubescens

注：1～13為不同批次(批號(hào)見(jiàn)表1)，14為對(duì)照藥材。圖9 不同批次玉葉金花薄層鑒別色譜結(jié)果Fig.9 TLC of different batches of M. Pubescens

表2 玉葉金花的水分、總灰分和醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果 Tab.2 Determination of moisture, total ash and alcohol soluble extracts of M.

3 討論

玉葉金花不僅可以作為藥物使用，還可食用，廣東等地常用玉葉金花制備涼茶[6]。玉葉金花資源豐富，使用價(jià)值廣泛，具有潛在的開(kāi)發(fā)和利用前景，建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一定的必要性。性狀鑒定、顯微鑒定和薄層色譜鑒定是中藥鑒定的常用方法[14]，具有快速、直觀和便捷等特點(diǎn)，對(duì)中藥材和飲片的鑒別具有重要意義。本研究對(duì)玉葉金花地上部分入藥藥材的性狀特征進(jìn)行了描述，并對(duì)干燥藥材葉表面制片的方法進(jìn)行考察，采用浸泡后撕取表皮和切取表皮等方法比較，最后發(fā)現(xiàn)撕取表皮制片的方法較好，最終成功地觀察到比較清晰和明顯的玉葉金花葉表皮特征，如平軸式的氣孔，垂周壁波狀彎曲的下表皮細(xì)胞，呈類(lèi)多角形的上皮細(xì)胞，表面光滑的非腺毛及長(zhǎng)方形、方形及類(lèi)圓形的石細(xì)胞等，這些特征均可作為玉葉金花鑒定的依據(jù)。

本研究通過(guò)考察不同溶劑(甲醇、三氯甲烷及乙酸乙酯等)、不同提取方法(超聲處理與回流)和不同時(shí)間等，最終得到最佳提取條件。進(jìn)一步考察不同展開(kāi)條件，包括三氯甲烷 ∶甲醇(8.5 ∶8.0)、三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(8.5 ∶1.5 ∶1.5)、三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(8.5 ∶0.5 ∶0.5)，確定最佳展開(kāi)條件。耐用性試驗(yàn)考察結(jié)果表明不同廠家薄層板、不同濕度和不同溫度下色譜圖的斑點(diǎn)清晰，均能較好的鑒別玉葉金花，說(shuō)明該方法適用性好，受相對(duì)濕度，溫度影響不明顯；穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果表明同一批玉葉金花粉末在不同放置時(shí)間下色譜圖無(wú)明顯差異，說(shuō)明樣品穩(wěn)定性良好，進(jìn)一步說(shuō)明該方法穩(wěn)定、可靠。將所建立的薄層色譜法對(duì)13批玉葉金花藥材進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示主斑點(diǎn)明顯、清晰及分離度好，且主斑點(diǎn)顏色和位置與對(duì)照藥材一致，進(jìn)一步說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，可以有效鑒別不同批次的玉葉金花藥材，同時(shí)色譜圖結(jié)果表明不同產(chǎn)地的藥材中主斑點(diǎn)顏色深淺不同，提示不同產(chǎn)地玉葉金花中該類(lèi)成分含量可能不同。

本研究對(duì)13批玉葉金花粉末進(jìn)行了水分、總灰分及醇溶性浸出物的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13批玉葉金花中水分含量范圍是9.20%～14.30%，平均含量為11.95%。總灰分含量范圍是5.26%～7.88%，平均含量為6.24%。因?yàn)橛袢~金花中的化學(xué)成分主要為皂苷、萜類(lèi)等，且現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)這些成分可能是其活性成分[9,11,15-20]，故以醇溶性浸出物作為玉葉金花質(zhì)量控制指標(biāo)之一，13批次玉葉金花醇溶性浸出物含量范圍是5.18%～8.80%，平均值含量為6.62%。不同產(chǎn)地的玉葉金花中水分、總灰分和醇溶性浸出物含量存在一定差異，可能與產(chǎn)地、氣候和采收時(shí)間有關(guān)，這些因素均有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究建立的玉葉金花的質(zhì)量控制研究方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，為該藥材的真實(shí)性鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。