艾玨萍 羅婷 吳安林 黃曉蒂 楊程 葉平 謝秀惠 彭亮

〔摘要〕 目的 觀察小魚際滾法對(duì)組織機(jī)化期骨骼肌鈍性損傷家兔纖連蛋白-1（fibronectin-1，F(xiàn)N-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子-1（connective tissue growth factor，CTGF-1）表達(dá)的影響。方法 選取30只成年新西蘭大耳白兔，隨機(jī)均分為手法治療組、模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，各10只。手法治療組予造模、治療處理，模型對(duì)照組予造模、不治療處理，空白對(duì)照組予不造模、不治療處理，采取自制重力鉛錘擊打兔右后下肢股四頭肌造成骨骼肌鈍性損傷模型，并在療程3 d后3組全處死，在兔股四頭肌受損區(qū)域內(nèi)取肌肉組織，HE染色觀察組織形態(tài)的變化，Western-Blot檢測(cè)治療前后FN-1、CTGF-1的變化情況。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：模型對(duì)照組與空白對(duì)照組對(duì)比，其模型對(duì)照組肌纖維受損較多，并有不規(guī)則結(jié)締樣組織填充其中;手法治療組與模型對(duì)照組對(duì)比，手法治療組新生的肌纖維及新生血管更明顯，炎性細(xì)胞較少，肌肉形態(tài)受損較輕。Western-Blot結(jié)果顯示：模型對(duì)照組FN-1、CTGF-1指標(biāo)顯著高于空白對(duì)照組，手法治療組FN-1、CTGF-1指標(biāo)均顯著高于空白對(duì)照組、低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在組織機(jī)化期骨骼肌鈍性損傷模型家兔股四頭肌修復(fù)過(guò)程中，運(yùn)用小魚際滾法治療，可有助修復(fù)受損的骨骼肌，使炎性細(xì)胞減少，促進(jìn)骨骼肌新生，改善家兔運(yùn)動(dòng)功能，提高療效，值得推廣應(yīng)用。

〔關(guān)鍵詞〕 骨骼肌;組織機(jī)化期;鈍性損傷;小魚際滾法;纖連蛋白-1;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子-1

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Interthenar rolling method on the expression of skeletal muscle blunt injury fibronectin-1 （Fibronecttin-1， FN-1） and connective tissue growth factor （CTGF-1） in rabbits with blunt injury of skeletal muscle in tissue mechanization stage. Methods A total of 30 adult New Zealand rabbits with big ears were randomly divided into a manual treatment group， a model control group and a blank control group， with 10 cases in each group. The manipulation treatment group was given model making and treatment， and the model control group was given modeling without treatment. The blank control group do not make model and treatment. A blunt injury model of skeletal muscle was made by hitting the rabbit's right lower limb quadriceps with a self-made homemade gravity lead hammer， and all the groups were sacrificed after 3 days of treatment. Muscle tissue was taken from the rabbit quadriceps damaged area， and HE staining was used for observing tissue morphological changes. The changes of Fibronectin-1 and CTGF-1 before and after treatment were detected by Western-Blot. Result The results of HE showed that compared with the model control group and the blank control group， the muscle fibers in the model control group were more damaged and serious than those in the manipulation treatment group， in which irregular connective tissue was filled. Compared with the manipulation treatment and model control group， the new muscle fibers and neovascularization in the manipulation treatment group were more obvious， and the inflammatory cells were fewer than those in the model control group. The results of Western-Blot showed that the indexes of FN-1 and CTGF-1 in the manipulation treatment group were significantly higher than those in the blank control group.The indexes of FN-1 and CTGF-1 in the manual treatment group were significantly higher than those of the blank control group and lower than those in the model control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion In the process of repairing quadriceps femoris in rabbits with blunt injury of skeletal muscle in organized phase， the method of interthenar rolling was used， which can help to repair the damaged skeletal muscle， to reduce inflammatory cells， to promote skeletal muscle regeneration， to improve the motor function of rabbits， and improve the curative effects. It is worthy of popularizing and applying.

〔Keywords〕 skeletal muscle; tissue mechanization period; blunt injury; interthenar rolling method; fibronectin-1; connective tissue growth factor-1

運(yùn)動(dòng)損傷中，骨骼肌損傷很常見，發(fā)生概率約10%～55%[1]，多由長(zhǎng)期性耐力運(yùn)動(dòng)引起，其比較常見的損傷類型有鈍挫性、撕裂性及牽拉性等。骨骼肌損傷后發(fā)生炎性反應(yīng)，局部瘢痕組織增生并纖維化，受損肌肉組織彈性漸漸喪失，伴有肌肉強(qiáng)硬、活動(dòng)性能下降，肌電指標(biāo)和生理生化指標(biāo)改變，如果得不到及時(shí)康復(fù)治療，愈合期拖延，甚至遷延不愈，最終可能造成受損的肌組織功能喪失[2]或組織脆性增加，極易發(fā)生再次損傷。因此，充分研究骨骼肌損傷機(jī)制，探討怎樣減少肌肉纖維化，提高患者功能恢復(fù)及生活質(zhì)量，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要課題。有前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞分化受多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路的調(diào)控，力學(xué)因素幾乎影響著體內(nèi)所有的細(xì)胞，細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、死亡都和細(xì)胞的力學(xué)特性有關(guān)[3]。而既往研究已證明，力學(xué)因素對(duì)肌成纖維細(xì)胞分化有十分重要影響，細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力釋放可直接導(dǎo)致其凋亡[4-5]。因此，手法或許能減少肌成纖維細(xì)胞的增生，促進(jìn)其凋亡，從而控制纖維化的進(jìn)程[6-7]。臨床研究證實(shí)[8-10]，對(duì)骨骼肌纖維化疾患，推拿療法對(duì)肌成纖維增生具有干預(yù)作用，但大多研究的推拿在骨骼肌鈍性損傷早期的作用機(jī)制，未研究推拿在骨骼肌鈍性損傷組織機(jī)化期的作用機(jī)制。本研究運(yùn)用小魚際滾法進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)纖維連接蛋白-1（fibronectin-1，F(xiàn)N-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子-1（connective tissue growth factor，CTGF-1）表達(dá)的影響，旨在確定在組織機(jī)化期小魚際滾法能否促進(jìn)骨骼肌鈍性損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，以期為推拿臨床治療提供更優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡健康SPF級(jí)成年新西蘭大耳白兔30只，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。體質(zhì)量252.41～320.67（315.71±22.98）g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度在50%～70%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，先隨機(jī)抽取空白對(duì)照組10只，余20只用自制重力鉛錘打擊裝置建立股四頭肌損傷模型后，按隨機(jī)數(shù)字表法均分為2組：模型對(duì)照組、小魚際滾法治療組（手法治療組），每組10只。

1.2? 主要儀器與試劑

蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)）;蛋白磷酸酶抑制劑（北京普利萊）;石蠟切片機(jī)（浙江金華）;標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置（北京六一）;ZTC-II按摩手法測(cè)試儀（上海騰蔭教學(xué)儀器有限公司提供）;自制股四頭肌損傷模型打擊裝置[11]。

1.3? 模型制備

造模前1天，對(duì)兔右后肢進(jìn)行剪毛處理。建模時(shí)，將家兔處仰位平置，捆綁固定，暴露股四頭肌和鄰近肌肉部位;以侯懿烜[11]自制重力錘直線下落擊打的造模方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)，采取右后肢股四頭肌肌腹中段做打擊中心，先鋪一層紗布以防皮膚損傷;用自制重力鉛錘（錘長(zhǎng)50 cm，重0.85 kg，底面平滑，直徑1.5 cm）沿PVC硬塑料導(dǎo)向管（長(zhǎng)40 cm，直徑1.8 cm）自由下落（自由落高40 cm），同一部位連續(xù)打擊4次，以肉眼可察受打擊部位呈現(xiàn)腫脹及瘀血，類似肌肉受撞擊損傷，無(wú)皮膚受損、無(wú)骨折，觸碰兔子有躲避反射為準(zhǔn)。5 d后模型建立成功（在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用新西蘭大耳白兔14只，動(dòng)物造模，測(cè)試鈍性損傷造模方法，于造模后第1、3、5、7、10、14、21天各隨機(jī)抽取2只，取股四頭肌肌肉組織，形態(tài)學(xué)觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證第5天進(jìn)入組織機(jī)化期表現(xiàn)）。

1.4? 治療方法

為保證每次手法操作標(biāo)準(zhǔn)化，在實(shí)驗(yàn)操作前檢測(cè)手法數(shù)據(jù)，規(guī)范手法操作參數(shù)。實(shí)驗(yàn)手法操作人員應(yīng)為針灸推拿學(xué)專業(yè)研究生，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)滾法參數(shù)，在ZTC-II按摩手法測(cè)試儀上測(cè)試并訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)手法操作人員達(dá)標(biāo)，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股四頭肌進(jìn)行練習(xí)，每天2次，每次操作練習(xí)3 min，總練習(xí)時(shí)間>30 min/d，連續(xù)練習(xí)3 d。

造模后第5天開始小魚際滾法治療，對(duì)手法治療組家兔進(jìn)行捆綁局部小魚際滾法治療，全程手法操作要求保持兔子情緒相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，防止應(yīng)激情況出現(xiàn)，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若行手法過(guò)程中家兔亂動(dòng)、亂叫可待其安靜后繼續(xù)施予小魚際滾法，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組捆綁后不做其他處理。

具體操作手法：先將家兔固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)處仰臥位，暴露股四頭肌和鄰近肌肉部位，以小魚際吸附于體表施術(shù)部位實(shí)施滾法，前后滾時(shí)著力輕重比為3∶1，峰值壓力為500 g重力，操作頻率為140次/min。每次操作5 min，每天上午、下午共2次，共治療3 d。

1.5? 取材及檢測(cè)

1.5.1? HE染色? 先烤片，再用石蠟切片機(jī)切片置于二甲苯中，然后梯度酒精脫水;染色，再梯度酒精脫水;最后取出后置于二甲苯，中性樹膠封片、顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5.2? Western-Blot檢測(cè)骨骼肌勻漿中FN-1、CTGF-1蛋白表達(dá)量? 取骨骼肌組織，放入容器中密封并凍存于-80 ℃冰箱，剪取0.030 g組織，加入400 ？滋L RIPA裂解液反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊，冰上裂解（10 min），4 ℃離心（15 min），將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，并測(cè)定蛋白濃度，取30 ？滋g蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，敷抗體，顯影。檢測(cè)骨骼肌勻漿中FN-1、CTGF-1蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參照蛋白，重復(fù)3次。

1.6? 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用“x±s”表示：符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析并進(jìn)行多重比較;不符合正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)并進(jìn)行多重比較。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 組織學(xué)觀察

HE染色觀察由圖1可見：空白對(duì)照組兔股四頭肌肌纖維大小較均一，形狀、分布較整齊，未見結(jié)締樣組織;模型對(duì)照組受損部分肌纖維較多受損扭曲、崩解、變性，分布較松散，不規(guī)則的結(jié)締樣組織填充其中，變性壞死肌纖維束周邊有較明顯的纖維樣組織增生包裹，可察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、少許自然恢復(fù)或新生的肌纖維及新生血管;手法治療組肌纖維形狀維持較好，肌纖維較粗，分布較緊密，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少及自然恢復(fù)或新生的肌纖維，與空白對(duì)照組對(duì)比還是可以觀察到少量的結(jié)締樣組織，與模型對(duì)照組對(duì)比，新生血管更明顯，組織病理結(jié)構(gòu)更接近正常組織。

2.2? FN-1和CTGF-1蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

由圖2和表1可見，在損傷手法治療后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和手法治療組在FN-1和CTGF-1的表達(dá)水平均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型對(duì)照組與手法治療組的FN-1、CTGF-1表達(dá)水平比較，模型對(duì)照組兩種蛋白水平均高于手法治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中，骨骼肌損傷屬于“筋傷”范圍?！墩f(shuō)文解字·筋部》：“筋，肉之力也……竹，物之多筋者?！敝?，是含纖維較多的物質(zhì);肉，即為肉體。肉、竹、力合起來(lái)，即纖維組織，為人體產(chǎn)生力量。肌肉收縮及神經(jīng)沖動(dòng)靠的是人體產(chǎn)生力量，因此，從現(xiàn)代意義看，《內(nèi)經(jīng)》中所指的筋就是肌肉和神經(jīng)[12]?！墩w類要》謂：“肢體損于外……臟腑由之不和?！盵13]俗語(yǔ)“傷筋動(dòng)骨”則說(shuō)明傷筋會(huì)影響骨骼。在骨折的同時(shí)也會(huì)有筋傷，兩者緊密相連。故筋絡(luò)骨，骨連筋，二者相互協(xié)同，才能保證人體關(guān)節(jié)的正?；顒?dòng)。而傳統(tǒng)推拿理論認(rèn)為[14]推拿具有舒經(jīng)通絡(luò)、活血化瘀、消腫止痛、放松肌肉、滑利關(guān)節(jié)等作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為在人體的關(guān)節(jié)、肌肉、韌帶、肌腱、鞘膜等特定部位，推拿通過(guò)手法可刺激受損肌組織及相鄰部位的經(jīng)絡(luò)，或經(jīng)過(guò)神經(jīng)反射調(diào)節(jié)機(jī)體生理、病理狀態(tài)以達(dá)到治療效果[15-16]，同時(shí)利用力學(xué)原理，推拿可糾正關(guān)節(jié)移位、錯(cuò)位，使脊柱、軀干、四肢得以維持其正常形態(tài)。這些都證明在骨骼和肌肉損傷康復(fù)治療方面，推拿治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

骨骼肌鈍性損傷組織機(jī)化期受到各類生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)，激活的肌衛(wèi)星細(xì)胞除部分負(fù)責(zé)自我更新外，大部分將轉(zhuǎn)化為具有增殖分化能力的成肌細(xì)胞，通過(guò)相互融合或與損傷殘留的肌纖維融合重建肌組織，以組織增生修復(fù)為主。因此，組織機(jī)化期骨骼肌鈍性損傷期應(yīng)以活血化瘀、理筋整復(fù)手法為主。臨床研究進(jìn)展表明，推拿滾法在臨床上應(yīng)用廣泛，尤以治療頸肩、腰部、肌肉運(yùn)動(dòng)損傷等方面臨床報(bào)道較多。近年來(lái)[18]，滾法被廣泛引用，屬推拿手法中頻繁使用的手法之一，不僅能擴(kuò)張血管、促進(jìn)推拿部位血液循環(huán)與淋巴循環(huán)，加快血氧代謝，改善微循環(huán)，從而達(dá)到祛瘀生新[19-21]作用。而且能減少炎性滲出，減少或預(yù)防粘連，促進(jìn)滲出液吸收、壞死組織清除，加快受損組織損傷修復(fù)[22-24]。

本實(shí)驗(yàn)手法治療組經(jīng)小魚際滾法治療后，通過(guò)HE染色觀察可見，手法治療組肌纖維形狀維持較好，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少且有新生的肌纖維。與模型對(duì)照組對(duì)比，新生血管更明顯，組織病理結(jié)構(gòu)更接近正常組織，說(shuō)明通過(guò)小魚際滾法治療，能減少肌成纖維細(xì)胞的增生，促進(jìn)肌纖維的恢復(fù)、增強(qiáng)血管新生、減少骨骼肌機(jī)化，功能上可有助受損的骨骼肌修復(fù)。通過(guò)WB結(jié)果顯示，模型對(duì)照組和手法治療組中FN-1、CTGF-1蛋白表達(dá)量比空白對(duì)照組高，手法治療組對(duì)比模型對(duì)照組FN-1和CTGF-1的蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低。其Fibronection[25]（FN）起調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)、分化，維持組織形態(tài)的作用。而[26]CTGF-1具有誘導(dǎo)橫向分化成肌細(xì)胞，促細(xì)胞增殖、黏附、趨化及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的能力。因此我們可以推斷，說(shuō)明在使用小魚際滾法治療可抑制FN-1、CTGF-1蛋白的表達(dá)，在損傷后小魚際滾法能減少肌成纖維細(xì)胞的增生，維持肌纖維形態(tài)、增強(qiáng)血管新生、減少骨骼肌機(jī)化，抑制瘢痕組織形成，對(duì)骨架形態(tài)恢復(fù)起一定作用。減少肌纖維生成，抑制組織機(jī)化。并結(jié)合動(dòng)物形態(tài)學(xué)觀察可見，擊打部位腫脹及淤血減退，較模型對(duì)照組明顯減輕，觸碰兔子無(wú)躲避反射，活動(dòng)情況（如跳躍、吃食）較模型對(duì)照組更自如。

因此，小魚際滾法對(duì)家兔股四頭肌損傷修復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：小魚際滾法能促進(jìn)肌肉修復(fù)有關(guān)的基因表達(dá)，可能與修復(fù)作用有關(guān)。運(yùn)用小魚際滾法對(duì)組織機(jī)化期骨骼肌鈍性損傷介入治療，提示了與運(yùn)動(dòng)損傷后功能障礙有密切關(guān)系，對(duì)推拿臨床治療有著重要指導(dǎo)作用，值得推廣應(yīng)用。

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