周連玉， 焦 璐， 李逢勁

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008)

虎掌菌(Sarcodonaspratus)又名翹鱗肉齒菌，是一種比較名貴的野生食用菌，其研究多集中于人工栽培[1-2]、組成成分的提取[3-5]以及活性的測定[6]等方面。以菌絲體生物量或胞外多糖為指標(biāo)，采用正交設(shè)計方法優(yōu)化液體培養(yǎng)虎掌菌發(fā)酵條件[7-8]。目前采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體和一些代謝物，可以克服栽培蕈菌子實體時遇到的困難。 微量元素硒(Se)在人及動物體內(nèi)發(fā)揮著許多生物學(xué)功能。硒的吸收利用與其化學(xué)形態(tài)有關(guān)，無機(jī)硒毒性較大且不利于吸收，而有機(jī)硒毒性較弱又利于吸收[9]。目前較多的生物可以將外源無機(jī)硒轉(zhuǎn)換為有機(jī)硒，香菇、靈芝、灰樹花、雞腿菇等多種蕈菌都具有富硒能力，并且不同的蕈菌液體耐硒能力不同[10-13]。適宜的亞硒酸鈉濃度可以增加不同蕈菌菌株液體發(fā)酵的菌絲體干重和發(fā)酵液中營養(yǎng)成分以及提高生物活性[13-15]。 而有關(guān)虎掌菌液體富硒培養(yǎng)的研究鮮見報道。 本研究采用多個衡量指標(biāo)通過三因素四水平正交設(shè)計優(yōu)化虎掌菌富硒液體發(fā)酵工藝條件，進(jìn)而篩選最佳發(fā)酵條件；基于優(yōu)化的發(fā)酵條件，添加不同硒濃度，探討硒對虎掌菌液體培養(yǎng)液中生物組分的影響，為更好理解蕈菌富硒機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為生產(chǎn)合適的硒源提供一種思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 虎掌菌(Sarcodonaspratus)菌株HZ,由青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：用于純化菌株和固體培養(yǎng)；液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL， pH 自然；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸膏15 g，KH2PO41.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-35HD型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(250B型，金壇市富華儀器有限公司)；超凈工作臺(CJ-1S型，天津市泰斯特儀器有限公司)；可見分光光度儀(V-5100型，金壇市富華儀器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-C型，金壇市天竟實驗儀器廠)；離心機(jī)(TD5A型，湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 虎掌菌固體富硒培養(yǎng) 分別制備含亞硒酸鈉濃度0(CK)、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的PDA平板，使用打孔器將虎掌菌菌落打孔成4 mm直徑規(guī)格的菌塊，接入制備好的平板中央，每個濃度重復(fù)10個培養(yǎng)皿， 25 ℃培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，觀察菌絲生長情況。

1.2.2 制備液體菌種 250 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，取3塊直徑4 mm菌塊接到三角瓶中，25 ℃，130 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，所得發(fā)酵液即為液體菌種。

1.2.3 虎掌菌液體富硒條件的優(yōu)化及驗證 選擇葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)、Na2SeO3(D)為主要影響因素，每個因素設(shè)定3個水平(表1)，通過正交試驗確定9個試驗組合(表2)，按5%接種量將液體菌種接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)6 d。以菌絲體干重、硒含量、還原糖、氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)為衡量指標(biāo)，根據(jù)正交試驗的結(jié)果選擇最優(yōu)發(fā)酵條件的組合進(jìn)行驗證試驗。

表1 富硒虎掌菌液體培養(yǎng)的正交試驗設(shè)計

1.2.4 不同濃度硒對虎掌菌液體培養(yǎng)的影響 結(jié)合上述試驗結(jié)果，選擇最佳的發(fā)酵條件，分別配置含亞硒酸鈉濃度為0(CK)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的液體培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中裝入95 mL的培養(yǎng)液，接入5 mL液體菌種，25 ℃培養(yǎng)6 d。

1.2.5 測定指標(biāo) ①菌絲體生物量：將發(fā)酵產(chǎn)物4 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體于60 ℃烘干至恒重，電子分析天平稱重。②pH：pH測試儀測定發(fā)酵液的pH。③氨態(tài)氮：甲醛滴定法測定發(fā)酵液氨態(tài)氮含量[16]。④蛋白質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)G-250法測定發(fā)酵液蛋白質(zhì)的含量。⑤還原糖：3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定發(fā)酵液還原糖的含量[16]。⑥總糖：蒽酮-硫酸法測定發(fā)酵液總糖的含量[16]。⑦硒含量：廣東東方縱橫檢測有限公司采用GB5009.93-2017氫化物原子熒光光譜法[17]測定發(fā)酵液和菌絲體的硒含量。

1.2.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各項指標(biāo)采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析或單因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度對虎掌菌菌絲生長的影響

由圖1可以看出，在固體培養(yǎng)基上不同濃度的亞硒酸鈉對虎掌菌菌絲生長有一定的抑制作用，且隨著亞硒酸鈉濃度的增加，其抑制作用呈增強(qiáng)趨勢。

圖1 虎掌菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d菌落特征的正面視圖(A)和反面視圖(B)Fig.1 Upper surface (A) and underside (B) of the 10 day colony of S. aspratus cultured in PDA medium 從左至右亞硒酸鈉濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L Sodium selenite concentrations from left to right are 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mmol/L, respectively

2.2 虎掌菌液體富硒條件的優(yōu)化

采用四因素三水平的正交試驗得到各項指標(biāo)的測定值(表2)，并進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。以菌絲體干重為指標(biāo)，由表3可知，各因素影響效果大小為亞硒酸鈉>KH2PO4>葡萄糖>酵母浸膏，最佳組合為A3B2C3D2。以菌絲體硒含量為指標(biāo)，各因素影響效果大小為Na2SeO3>葡萄糖>酵母浸膏>KH2PO4，最佳組合為A1B3C3D3。以發(fā)酵液硒含量為衡量指標(biāo)，影響效果大小依次為酵母浸膏>Na2SeO3>KH2PO4>葡萄糖，最佳組合為A3B1C3D3。以蛋白質(zhì)含量為衡量指標(biāo)的影響效果大小依次為葡萄糖>KH2PO4>Na2SeO3>酵母浸膏，最佳組合為A1B3C3D3。以氨態(tài)氮含量為衡量指標(biāo)，影響效果大小依次為酵母浸膏>KH2PO4>葡萄糖>Na2SeO3，最佳組合為A1B3C3D3。以還原糖含量為衡量指標(biāo)的影響效果大小依次為葡萄糖>酵母浸膏>Na2SeO3>KH2PO4，最佳組合為A3B2C1D3。

表2 富硒虎掌菌正交試驗

表3 正交試驗極差分析

2.3 驗證虎掌菌富硒發(fā)酵條件

以菌絲體干重、硒含量、還原糖、氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)為衡量指標(biāo)，得到4種最優(yōu)組合的富硒發(fā)酵條件，進(jìn)一步驗證，結(jié)果見表4。與CK處理相比，虎掌菌在4種優(yōu)化發(fā)酵條件下所獲得菌絲體生物量、氨態(tài)氮以及還原糖的含量均顯著性增多(P<0.05)，而蛋白質(zhì)的含量顯著性減少(P<0.05)，綜合各項指標(biāo)，以還原糖含量為指標(biāo)的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的還原糖、氨態(tài)氮及菌絲體生物量均較高，所以確定最佳發(fā)酵條件為葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.6 mmol/L。

2.4 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)生物組分的影響

2.4.1 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體和pH的影響 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體生物量和pH的影響見圖2。與CK相比較，0.1～0.3 mmol/L硒濃度下，pH值有所增高，而0.4～0.7 mmol/L硒濃度下，pH值有所降低。與CK相比較，0.2 mmol/L硒濃度培養(yǎng)情況下，菌絲體干重含量最高。

表4 富硒虎掌菌正交試驗的驗證結(jié)果

注：1：以菌絲體干重為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.4 mmol/L； 2：以還原糖含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L；3：以氨態(tài)氮、蛋白質(zhì)、發(fā)酵液硒含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L；4：以菌絲體硒含量為指標(biāo)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：葡萄糖2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏4.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、 Na2SeO30.6 mmol/L。同列的小寫字母表示試驗組之間所測指標(biāo)的顯著性差異(P<0.05)

2.4.2 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖和總糖的影響 從圖3可以看出，不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖和總糖的影響，與CK相比較，加硒后發(fā)酵液中還原糖及總糖顯著增多(P<0.05)。在硒濃度為0.5 mmol/L時，還原糖和總糖含量達(dá)到最高值。

圖2 不同硒濃度對虎掌菌液體 培養(yǎng)菌絲體和pH的影響Fig.2 Effects of selenium concentration on mycelial and pH of S. aspratus in liquid culture小寫字母表示不同硒濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in mycelial of S. aspratusin liquid culture(P<0.05)

圖3 不同硒濃度對虎掌菌液體 培養(yǎng)還原糖和總糖的影響Fig.3 Effects of selenium concentration on reducing sugar and total sugar of S. aspratus in liquid culture小寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)還原糖的顯著性差異(P<0.05)，大寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)總糖的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in reducing sugar of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)， Non-matching upper case letters indicate a significant difference in total sugar of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)

2.4.3 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響結(jié)果見圖4。與CK相比較，不同硒濃度培養(yǎng)情況下氨態(tài)氮含量顯著增加(P<0.05)，當(dāng)硒濃度為0.5 mmol/L時氨態(tài)氮含量達(dá)到最高值。與CK相比較，硒濃度為0.3～0.4 mmol/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著性增多，而其他硒濃度下，可溶性蛋白質(zhì)顯著下降(P<0.05)。

圖4 不同硒濃度對虎掌菌液體培養(yǎng) 氨態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effects of selenium concentration on ammonia nitrogen and soluble protein of S. aspratus in liquid culture 小寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)氨態(tài)氮的顯著性差異，大寫字母表示不同濃度之間虎掌菌液體培養(yǎng)可溶性蛋白質(zhì)的顯著性差異(P<0.05) Non-matching lower case letters indicate a significant difference in ammonia nitrogen of S. aspratus in liquid culture(P<0.05), Non-matching upper case letters indicate a significant difference in soluble protein of S. aspratus in liquid culture(P<0.05)

3 討 論

一些研究者通過添加不同濃度的硒源研究蕈菌菌絲在固體培養(yǎng)基上的耐受力。香菇Q12菌株菌絲在0～110 mg/L不同亞硒酸鈉的固體培養(yǎng)基上均能生長，0～30 mg/L菌絲生長速度不斷增加，而大于30 mg/L后，菌絲生長速度逐漸降低[18]。用含有不同濃度亞硒酸鈉(0、20、50、100、150、200、250、300 mg/kg)的固體培養(yǎng)基對灰樹花GF5菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲在含20～100 mg/kg平板上能正常萌發(fā)，其生長速度明顯高于對照；150～200 mg/kg硒濃度抑制菌絲萌發(fā)和生長速度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)虎掌菌在不同亞硒酸鈉0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L條件下，隨著硒濃度增加菌絲生長的速度減慢(圖1)?？梢姴煌鷮ξ哪褪苄圆煌?。

蕈菌液體富硒培養(yǎng)產(chǎn)生的菌絲生物量、菌體含硒量等物質(zhì)與所選擇的培養(yǎng)基成分及含量有關(guān)。以大球蓋菇菌絲體生物量、總硒濃度、富硒率和有機(jī)化程度為指標(biāo)，選取葡萄糖、酵母浸粉和亞硒酸鈉進(jìn)行L9(33)正交試驗，對培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。極差分析結(jié)果表明各因素對大球蓋菇生物量和富硒的影響大小依次為亞硒酸鈉添加量>酵母浸粉>葡萄糖，最優(yōu)組合為葡萄糖20 g/L、酵母浸粉4 g/L、Na2SeO3·5H2O 20 mg/L[19]。以菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率為指標(biāo)，碳源、氮源、pH、維生素4 種因素對茶樹菇3個指標(biāo)的影響主次關(guān)系不一致，根據(jù)硒含量和富硒率確定最優(yōu)組合[20]。本研究結(jié)果表明，4個因素對不同指標(biāo)的影響也有差異，通過驗證試驗得到最優(yōu)組合為葡萄糖 6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酵母浸膏 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、KH2PO40.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))、Na2SeO30.6 mmol/L。不同蕈菌采用不同的衡量指標(biāo)得到的富硒液體優(yōu)化條件不同。

通過微生物富集硒后，菌絲體或發(fā)酵液的營養(yǎng)價值會發(fā)生變化。不同亞硒酸鈉濃度(0～300 mg/L)對金耳發(fā)酵液中游離氨基酸、蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量的作用也各異[14]，當(dāng)在10 mg/L濃度下蛋白質(zhì)含量最多，而游離氨基酸的含量為最低值；總糖和還原糖的的含量隨著Na2SeO3濃度的增加而逐漸增加，而菌絲生長量反之下降。本研究為亞硒酸鈉濃度為0～0.7 mmol/L，在0.2 mmol/L濃度下菌絲體生物量最多，還原糖和總糖含量均為硒濃度為0.5 mmol/L時達(dá)到最高值；與CK相比較，不同硒濃度促進(jìn)氨態(tài)氮顯著增加(P<0.05)，當(dāng)硒濃度為0.3～0.4 mmol/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著性增多(P<0.05)。不同菌株在一定硒濃度下富硒后能提高蕈菌代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)價值，因此可作為補(bǔ)硒營養(yǎng)品。

本研究發(fā)現(xiàn)虎掌菌具有一定耐硒能力，以不同指標(biāo)得到不同的虎掌菌富硒發(fā)酵條件，經(jīng)過驗證試驗得出虎掌菌富硒最優(yōu)條件，不同濃度的硒對虎掌菌液體培養(yǎng)液中的pH、菌絲體、還原糖、總糖、氨態(tài)氮和蛋白質(zhì)有一定的影響，而對虎掌菌液體培養(yǎng)菌絲體中生物組分或生物組分的生物活性的影響還有待進(jìn)一步研究。