肝內(nèi)固有抗原遞呈細(xì)胞調(diào)控抗HBV免疫應(yīng)答的作用及機(jī)制

謝曉紅， 楊東亮， 劉 嘉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 感染科， 武漢 430022

據(jù)2006年的統(tǒng)計資料，我國現(xiàn)有慢性HBV感染者9300萬人，其中慢性乙型肝炎(CHB)約2000萬例，每年約有30萬人死于CHB所導(dǎo)致的終末期肝病，如肝硬化和肝癌[1]。闡明HBV持續(xù)性感染的機(jī)制，探索清除HBV持續(xù)性感染的新靶點(diǎn)和新策略是該領(lǐng)域亟待解決的重大科學(xué)問題。

作為被HBV侵犯的主要器官，肝臟具有極其特殊的解剖結(jié)構(gòu)和免疫微環(huán)境。肝血竇是肝臟所獨(dú)有的特殊結(jié)構(gòu)，是肝臟微循環(huán)血流灌注和免疫應(yīng)答的主要發(fā)生部位。血液中的各種成分(如淋巴細(xì)胞和病原體等)在肝血竇內(nèi)可較長時間停留，并充分與肝血竇內(nèi)的各種細(xì)胞發(fā)生相互作用，這一過程對于肝內(nèi)天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生非常重要[2]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)和枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KC)是肝血竇內(nèi)最主要的固有抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，可從血液循環(huán)中有效攝取、加工抗原并交叉遞呈給特異性CD8+T淋巴細(xì)胞。既往研究[3-5]認(rèn)為，與成熟的專職APC遞呈誘導(dǎo)特異性CD8+T淋巴細(xì)胞活化不同，LSEC和KC交叉遞呈抗原往往誘導(dǎo)特異性CD8+T淋巴細(xì)胞形成耐受，表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞喪失細(xì)胞毒效應(yīng)及產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)胞因子(IFNγ和IL-2等)的能力。近年來的研究顯示，除誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞耐受外，LSEC和KC等肝內(nèi)APC在特定條件下，也可促進(jìn)肝內(nèi)抗HBV免疫應(yīng)答的發(fā)生，從而介導(dǎo)HBV的清除(表1)。本文就肝內(nèi)固有APC調(diào)控肝內(nèi)抗HBV免疫應(yīng)答的作用及機(jī)制加以綜述。

1 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)

LSEC構(gòu)成了肝血竇的血管壁，是肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要群體，約占肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的50%。由于LSEC在肝血竇中所處的特殊位置，其暴露于血液中各種成分的刺激之下，并與血液中的淋巴細(xì)胞存在著密切的相互作用。LSEC是一種高效的APC，表達(dá)參與抗原遞呈過程的多種分子，如CD54、CD80、CD86、MHCⅠ/Ⅱ和CD40等，可向CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞遞呈抗原[6-7]，從而調(diào)控肝內(nèi)的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。

1.1 LSEC介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞耐受 與DC類似，來自于病毒等病原體的外源性抗原可以被LSEC攝取和加工處理，并以交叉遞呈的方式遞呈給抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞[7]。且其交叉遞呈可溶性抗原的能力相較于DC更為高效[8]。與在淋巴結(jié)內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞不同，LSEC交叉遞呈致敏的抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞會在肝內(nèi)滯留[9]。LSEC遞呈抗原給CD8+T淋巴細(xì)胞后，在最初的24 h內(nèi)T淋巴細(xì)胞表面CD25、CD44和PD-1等分子的表達(dá)升高，CD62L的表達(dá)下降，抗原特異性T淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖[6,10]，這一過程與成熟DC致敏CD8+T淋巴細(xì)胞的過程相似。但與DC致敏誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞持續(xù)增殖不同，LSEC致敏的T淋巴細(xì)胞只發(fā)生短暫地增殖[11]。LSEC表面高表達(dá)PD-L1(B7-H1)分子，抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞被致敏后PD-1分子表達(dá)上調(diào)，二者相互作用，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞無法進(jìn)一步持續(xù)活化[10,12]。LSEC表面表達(dá)的MHC-Ⅰ和CD54等分子決定了LSEC對CD8+T淋巴細(xì)胞的黏附能力[13]，這兩種細(xì)胞相互作用之后，LSEC表面CD54分子進(jìn)一步上調(diào)，從而穩(wěn)定LSEC對T淋巴細(xì)胞的抑制作用[9]。但T淋巴細(xì)胞也不會經(jīng)歷凋亡，其機(jī)制可能與LSEC致敏的CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)大量的抗凋亡分子bcl-2有關(guān)[10]。未經(jīng)刺激的LSEC幾乎不表達(dá)IL-12，這一關(guān)鍵共刺激信號的缺失，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞被LSEC致敏后的活化無法持續(xù)，IFNγ的產(chǎn)生水平低下[14]。最終被LSEC致敏的T淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)形成耐受，接受TCR再刺激后缺乏IL-2和IFNγ等效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]，IL-2缺乏進(jìn)一步抑制CD8+T淋巴細(xì)胞活化[6]。此外，LSEC可通過影響其他細(xì)胞功能調(diào)控肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。LSEC與肝內(nèi)DC相互接觸后，可降低DC表面CD80/CD86等共刺激分子的表達(dá)，抑制DC對初始T淋巴細(xì)胞的活化功能[15]。LSEC還可以以TGFβ依賴的方式誘導(dǎo)Treg的生成，抑制T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]。通過LSEC遞呈抗原，被致敏的CD4+T淋巴細(xì)胞會發(fā)生增殖，但是不能分化為促炎性的Th1[14]。相反，LSEC可以促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化并分泌IL-4[4]。其機(jī)制可能為生理?xiàng)l件下門靜脈血中內(nèi)毒素誘導(dǎo)LSEC產(chǎn)生IL-10和前列腺素E2，降低LSEC表面MHCⅡ和CD86等分子的表達(dá)，從而抑制了LSEC致敏CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ的水平，更易向Th2方向分化[16]。上述因素共同參與了LSEC介導(dǎo)的肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫耐受形成。

1.2 LSEC介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答 越來越多研究表明，在特定條件下，例如在病毒感染或特定天然免疫通路活化等條件下，LSEC可逆轉(zhuǎn)其耐受屬性并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。加入CD28可以解除B7-H1依賴的LSEC介導(dǎo)的CD8+T淋巴細(xì)胞的耐受性，表明共刺激/共抑制平衡決定了免疫耐受或免疫活化狀態(tài)[17]。靜息狀態(tài)下LSEC缺乏IL-12表達(dá)，而外源性IL-12則增加了LSEC對記憶和幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞的輔助功能。在組織損傷時單核細(xì)胞會滲透到肝臟，由肝臟的APC誘導(dǎo)的局部免疫反應(yīng)可以通過血液來源的單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12增強(qiáng)[14]。有趣的是，將脾臟細(xì)胞加入到LSEC和CD4+T淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，導(dǎo)致了Th1表型的誘導(dǎo)，這表明LSEC介導(dǎo)的幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞的失活可以被其他APC細(xì)胞群所克服[14]。筆者前期的研究[12]也顯示，TLR1/2配體刺激LSEC可誘導(dǎo)其活化，分泌IL-12且維持PD-L1表達(dá)水平不上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞增殖并且產(chǎn)生IFNγ。改變抗原濃度也會對LSEC的免疫活性產(chǎn)生影響。LSEC遞呈低濃度卵清白蛋白抗原時，誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生耐受，而當(dāng)提高抗原濃度10倍，LSEC不僅不能誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生耐受，相反，CD8+T淋巴細(xì)胞分化為功能性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞[18]。Kern等[19]在小鼠巨細(xì)胞病毒感染模型中首次表明，病毒感染LSEC后可誘導(dǎo)其功能成熟，進(jìn)而促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞免疫。Bottcher等[20]首次提出LSEC交叉遞呈抗原致敏的抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞還存在第三種命運(yùn)，即分化為具有增殖潛能的記憶性T淋巴細(xì)胞。這些記憶性T淋巴細(xì)胞與中樞記憶性T淋巴細(xì)胞相似，可重新定位到次級淋巴組織，再次接受TCR/CD28/IL-12共同刺激時，可以快速分化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。這種記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞分化伴隨著迅速而短暫的顆粒酶B(GzmB)的表達(dá)和效應(yīng)功能的誘導(dǎo)，早期短暫的GzmB表達(dá)依賴于LSEC分泌的IL-6介導(dǎo)的跨信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[21]。在此過程中，如果存在激活的Th1，其分泌的IL-2可顯著增強(qiáng)LSEC致敏的CD8+T淋巴細(xì)胞GzmB的表達(dá)水平，且啟動更加迅速[22]。

LSEC的活化狀態(tài)對調(diào)控肝內(nèi)抗HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答至關(guān)重要。筆者的研究[23-24]顯示，刺激NOD1信號通路在體內(nèi)體外均可誘導(dǎo)LSEC活化和成熟，促進(jìn)肝內(nèi)抗HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)而在HBV慢性復(fù)制小鼠模型中加速HBV的清除。在HBV自然感染過程中，T淋巴細(xì)胞表面膜CD100會被剪切釋放形成可溶性CD100，這一分子可誘導(dǎo)LSEC活化，進(jìn)而促進(jìn)抗HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答并介導(dǎo)病毒的肝內(nèi)清除[25]。筆者新近研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染過程中產(chǎn)生的HBeAg也具有誘導(dǎo)LSCE的免疫功能成熟進(jìn)而促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞免疫功能的作用。此外，LSEC表面可結(jié)合活化的血小板，進(jìn)而使得活化的HBV特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可以錨著于其表面，通過LSEC間的窗隙與HBV感染的肝細(xì)胞接觸，發(fā)揮殺傷作用[26]。上述機(jī)制顯示LSEC在急性HBV感染的肝內(nèi)免疫清除過程中發(fā)揮了重要作用。

2 枯否細(xì)胞(KC)

KC是肝臟的常駐巨噬細(xì)胞，除了由肝源性前體維持[27]，還可以以巨噬細(xì)胞集落刺激因子依賴的方式從單核細(xì)胞衍生。它們與LSEC一起形成應(yīng)對病原體入侵肝臟的第一道屏障。KC的主要功能是清除門靜脈循環(huán)中的內(nèi)毒素、釋放可溶性介質(zhì)和提供抗原，有效地將抗原呈遞給免疫活性細(xì)胞[28-30]。在抗原攝取或刺激下，KC可被激活并分泌一系列的細(xì)胞因子(IFNα/β、TNFα)，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞的招募[31-32]。

2.1 KC介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞耐受 KC是肝內(nèi)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的重要參與者，通常與維持肝臟免疫耐受環(huán)境相關(guān)[33]。在體外誘導(dǎo)分化之后，KC顯示出更快速且持續(xù)地上調(diào)抗炎細(xì)胞因子編碼基因的表達(dá)[34]。相較于脾臟DC致敏的T淋巴細(xì)胞，KC致敏的T淋巴細(xì)胞表達(dá)相當(dāng)水平的CD69，但CD25表達(dá)水平及IL-2分泌水平低下，從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞失能[35]。在脂多糖刺激下，KC同樣釋放出大量的IL-10[36]，而生理?xiàng)l件下門靜脈血中內(nèi)毒素即可誘導(dǎo)KC分泌IL-10[16]，肝竇局部IL-10濃度較高，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞耐受。與此一致，IL-10受體阻斷可以部分恢復(fù)CD8 T淋巴細(xì)胞功能[37]。此外，與LSEC相同，KC可以抑制DC誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞活化[35]。在病毒性肝炎中，大多數(shù)KC被激活并表達(dá)高水平的CD80、CD40和MHC-Ⅱ分子，從而獲得專職APC的表型[38]。

HBV感染的慢性化與年齡顯著相關(guān)，KC在這一過程中發(fā)揮重要作用。研究[39]顯示，HBV陽性孕鼠的HBeAg可刺激子代小鼠的KC，誘導(dǎo)其分化為M2型巨噬細(xì)胞并上調(diào)PD-L1的表達(dá)，從而抑制抗HBV特異性的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。這些HBeAg暴露過的子代小鼠出生后再次接受HBV攻擊后會發(fā)展為慢性化感染。此外，接受HBV攻擊后，幼年小鼠的慢性化比例要顯著高于成年小鼠。進(jìn)一步研究[40]顯示成年小鼠肝內(nèi)KC較幼年小鼠顯著減少，且其細(xì)胞上的TLR4表達(dá)也較幼年小鼠低，也提示了KC在介導(dǎo)HBV慢性化的過程中發(fā)揮重要作用。敲除幼年小鼠的KC可增強(qiáng)Ly6C+單核細(xì)胞的肝內(nèi)募集，促進(jìn)HBV特異性CD8 T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增及效應(yīng)功能，加速HBV的清除[40-41]。乙型肝炎核心抗原可通過激活TLR2信號通路誘導(dǎo)KC產(chǎn)生IL-10，從而誘導(dǎo)HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞耐受并致感染慢性化[42]。TLR2基因敲除或敲除小鼠的KC可增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)HBV的清除[42]。筆者近期研究[37]也發(fā)現(xiàn)，HBsAg也可通過TLR2信號通路誘導(dǎo)KC擴(kuò)增以及增加IL-10的分泌，進(jìn)而抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的功能。另外，HBeAg通過抑制NF-κB磷酸化以及抑制活性氧生成，抑制KC的NLRP3炎癥小體活化與IL-1β產(chǎn)生，這可能也是HBV免疫耐受形成的機(jī)制之一[43]。

2.2 KC介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞活化 KC可以在肝臟原位激活抗原特異性CD4+T淋巴細(xì)胞[44]。KC識別HBV或HBsAg后，迅速誘導(dǎo)IL-6、IL-1β、TNFα產(chǎn)生，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞活化[45],并且可以在感染早期控制HBV復(fù)制[46]。Poly I:C可以顯著上調(diào)KC表達(dá)MHC-Ⅱ、B7-1、B7-2和ICAM-1，增強(qiáng)活化T淋巴細(xì)胞的功能；另一方面，吲哚美辛可以抑制KC分泌前列腺素，抑制KC介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞耐受[35]。Poly I:C還能上調(diào)KC表達(dá)CXCL13，促進(jìn)肝內(nèi)免疫，加速HBV清除[47]。KC在炎癥刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞因子也可影響肝竇內(nèi)其他細(xì)胞的活性[36]。

3 肝內(nèi)其他APC

肝竇內(nèi)的低速血流有利于淋巴細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的相互接觸。肝臟微絨毛可以通過LSEC窗隙延伸到肝竇腔[48]。T淋巴細(xì)胞胞質(zhì)也會形成偽足穿過LSEC窗孔延伸到Disse腔，與肝細(xì)胞微絨毛緊密接觸[26,49]。肝細(xì)胞表面大量表達(dá)MHC-Ⅰ和ICAM-1分子，可遞呈抗原給T淋巴細(xì)胞[50]。值得注意的是，肝臟ICAM-1并非均勻分布，而是集中分布在肝竇表面。LFA-1在淋巴細(xì)胞微絨毛上表達(dá)，可能通過其配體ICAM-1與肝細(xì)胞相互作用[49]。新近研究[51]顯示，HBV感染過程中，肝細(xì)胞可遞呈抗原給CD8+T淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)其活化和增殖，但不能使其分化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，而是表現(xiàn)為功能耗竭T淋巴細(xì)胞的特征。如果給與IL-2信號刺激，可挽救這些T淋巴細(xì)胞的功能。

肝星狀細(xì)胞也能夠處理外源性抗原肽，遞呈給CD4+T淋巴細(xì)胞，并以交叉遞呈的方式致敏CD8+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化并發(fā)揮功能[52]。

4 總結(jié)與展望

肝內(nèi)固有APC在調(diào)控肝臟免疫應(yīng)答、維持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下，肝內(nèi)固有APC可以通過多種機(jī)制誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞耐受，避免肝內(nèi)病理免疫損傷的發(fā)生。然而，上述機(jī)制也會被HBV利用從而幫助其建立持續(xù)性感染。隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)在HBV感染過程中，多種機(jī)制參與了調(diào)控肝內(nèi)固有APC的活化狀態(tài)，進(jìn)而決定肝內(nèi)抗HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度并影響病毒的清除。但目前對于肝內(nèi)APC功能的研究多停留在單個細(xì)胞亞群的水平，仍缺乏對肝內(nèi)不同細(xì)胞群體間以及肝內(nèi)和肝外免疫細(xì)胞間的互作網(wǎng)絡(luò)的整體認(rèn)識。進(jìn)一步深入闡明相關(guān)機(jī)制將為探索更有效的阻斷HBV持續(xù)性感染的免疫干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 肝內(nèi)固有APC調(diào)控肝內(nèi)抗HBV免疫應(yīng)答的作用及機(jī)制