宋姍姍，聶艷紅，張春芳，林海月，張強(qiáng)，陳昊△

乳腺癌作為一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已躍居女性惡性腫瘤的首位［1］。2013年St Gallen乳腺癌會(huì)議國(guó)際共識(shí)［2］根據(jù)雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）及增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67）的表達(dá)，將乳腺癌分為腺腔A 型（LA）、腺腔B 型（LB）、HER-2 過(guò)表達(dá)型（HER-2+）和三陰性乳腺癌（TNBC）4 種亞型。乳腺癌不同分子分型的個(gè)體化治療已在臨床廣泛應(yīng)用［3］，但TNBC 型對(duì)內(nèi)分泌治療、HER-2 靶向治療均不敏感，對(duì)常規(guī)化療也不敏感，是目前唯一未建立特異性靶向治療的亞型，因此尋找特異性治療靶點(diǎn)是TNBC 研究的熱點(diǎn)［4］。再生胰島衍生家族成員（regenerating islet-derived family member，Reg）Ⅳ是從炎癥性腸病基因庫(kù)中篩選出的一種新的Reg家族亞型［5］。其主要在近端胃腸道表達(dá)，且異常表達(dá)于炎癥損傷及腫瘤組織中［6-7］，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及抗凋亡等［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中Reg Ⅳ與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)Reg Ⅳ是EGFR/Akt/AP-1 通路的上游因子［10-12］。由于TNBC 中亦有EGFR 相關(guān)信號(hào)通路的激活［13-14］，筆者推測(cè)Reg Ⅳ可能在TNBC 中發(fā)揮作用。鑒于此，本研究采用免疫組化染色、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和生物數(shù)據(jù)庫(kù)大數(shù)據(jù)分析Reg Ⅳ在乳腺癌和不同分子分型中的表達(dá)及意義，為乳腺癌的診斷、治療和臨床評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港第一人民醫(yī)院2017 年1 月—2019 年5 月的手術(shù)切除標(biāo)本?；颊呔鶠榕裕中g(shù)前未進(jìn)行放化療，所有病例均由2位正高級(jí)病理醫(yī)師證實(shí)。乳腺癌組織共140 例，其中LA 型30 例，LB 型50 例（HER 陰性亞型和陽(yáng)性亞型各25 例），HER2+型30 例，TNBC型30 例；正常乳腺組織75 例（距癌組織＞5 cm）作為對(duì)照。每例標(biāo)本分別收集2 份，1 份標(biāo)本于甲醛固定行免疫組化染色，另1份用于qRT-PCR。

1.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒（南京諾唯贊公司）。GAPDH內(nèi)參引物（江蘇凱基公司）；Reg Ⅳ引物上游：CTGCTCCTATTGCTGAGCTG，下游 : GGACTTGTGGTAA AACCATCCAG［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Reg Ⅳ一抗（美國(guó)Proteintech 公司），ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR一抗（廣州安必平公司）；過(guò)氧化物酶阻斷劑、三合一抗原修復(fù)液、二抗、DAB顯色液、PBS（美國(guó)DAKO公司）。

1.3 免疫組化染色檢測(cè)Reg Ⅳ蛋白的表達(dá)及結(jié)果判讀 采用EnVison 法。3.7%中性甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化自動(dòng)染色儀行免疫組化染色。以結(jié)腸癌作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。Reg Ⅳ主要表達(dá)于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合計(jì)分。（1）隨機(jī)讀取5～10 個(gè)高倍鏡視野（×400）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，1%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。（2）按照著色強(qiáng)弱計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。（3）陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積進(jìn)行綜合判斷：≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性。依據(jù)2012年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）的標(biāo)準(zhǔn)判讀ER、PR表達(dá)。依據(jù)2013 年ASCO/CAP 乳腺癌HER-2 檢 測(cè)指南判讀HER-2 表達(dá)，其中HER-2（2+）進(jìn)一步行熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)；對(duì)于EGFR的判讀，存在明顯的胞膜染色即視為陽(yáng)性；Ki-67表達(dá)以20%為界，＜20%為低表達(dá)，≥20%為高表達(dá)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)Reg ⅣmRNA的表達(dá) 液氮研磨法提取總RNA，測(cè)其濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR 條件：預(yù)變性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。每個(gè)樣本復(fù)孔3次，得到熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的Ct值，取2-ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的比較。

1.5 生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析Reg ⅣmRNA的表達(dá)與預(yù)后 Kaplan-Meier Plotter 公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis）收錄了10 461 個(gè)癌癥樣本信息，其中包含5 143 例乳腺癌患者生存資料和基因表達(dá)信息。本研究分析該數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)3 951例乳腺癌患者Reg ⅣmRNA 的表達(dá)水平與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）、總生存期（OS）、無(wú)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)生存期（DMFS）、復(fù)發(fā)后生存期（PPS）的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料表達(dá)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析利用Kaplan-Meier 中Log-rank模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Reg Ⅳ蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá) Reg Ⅳ主要位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖1）。正常乳腺組織中Reg Ⅳ陽(yáng)性表達(dá)率為25.33%（19/75），乳腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率為49.29%（69/140），其中LA 型53.55%（16/30）、LB 型52%（26/50）、HER-2+型66.67%（20/30）、TNBC 型23.33%（7/30）。Reg Ⅳ蛋白在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織（χ2=11.589，P＜0.01），在非TNBC型（LA型、LB型及HER-2+型）乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于TNBC型（56.36%vs.23.33%，χ2=10.289，P＜0.01）。

2.2 RegⅣmRNA 在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果顯示，正常乳腺組織中RegⅣmRNA 的表達(dá)水平為1.19±0.47，乳腺癌中表達(dá)水平為2.04±0.66，其中LA 型為2.14±0.49、LB 型為2.26±0.55、HER-2+型為2.36±0.53、TNBC 型為1.25±0.48。Reg ⅣmRNA在乳腺癌中的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織（t=9.891，P＜0.01），正常乳腺組、非TNBC組和TNBC 組的Reg ⅣmRNA 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（F=117.100，P＜0.01），其 中 非TNBC 組（2.25±0.53）高于TNBC 組和正常乳腺組，正常乳腺組與TNBC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Reg Ⅳ與乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物及臨床病理特征間的關(guān)系 ER+、PR+、HER-2+組中Reg ⅣmRNA表達(dá)水平明顯高于各自陰性表達(dá)組（P＜0.01），但EGFR陽(yáng)性組和陰性組及Ki-67高表達(dá)和低表達(dá)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。40歲以上患者中RegⅣmRNA的表達(dá)水平高于40歲及以下患者；在腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者RegⅣmRNA水平分別高于直徑＞2 cm組和Ⅲ～Ⅳ期組；而在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、不同組織學(xué)分級(jí)、不同側(cè)別組中Reg ⅣmRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者RegⅣmRNA 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)顯示乳腺癌患者Reg ⅣmRNA的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。Reg Ⅳ高表達(dá)患者RFS、OS、DMFS 和PPS較低表達(dá)者明顯延長(zhǎng)，預(yù)后較好，見(jiàn)圖2。

Fig.1 Immunohistochemical staining of RegⅣin normal breast and breast cancer tissues(EnVision methord，×200)圖1 Reg Ⅳ在正常乳腺組織和乳腺癌中的表達(dá)（EnVision法，×200）

3 討論

盡管基于ER、PR和HER-2的個(gè)體化治療降低了患者的病死率，但乳腺癌患病基數(shù)大，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)［15］。鑒于乳腺癌的分子分型對(duì)治療及預(yù)后評(píng)估的重要參考價(jià)值［16］，筆者從分子分型角度探討RegⅣ在乳腺癌中的表達(dá)及意義。不同于Oue等［17-18］的結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)Reg Ⅳ在正常乳腺中的表達(dá)低于乳腺癌，可能是由于文獻(xiàn)中的組織學(xué)類型不同（研究對(duì)象僅為少量乳腺印戒細(xì)胞癌的患者），或文獻(xiàn)中樣本量較小導(dǎo)致。在乳腺癌4種分子分型中，Reg Ⅳ在非TNBC型乳腺癌中的表達(dá)明顯高于TNBC型，且正常乳腺組織與非TNBC型乳腺癌中差異明顯，與TNBC型無(wú)明顯差異，表明Reg Ⅳ可能與非TNBC型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果亦表明，Reg Ⅳ與ER、PR、HER-2有關(guān)，這可能是Reg Ⅳ在不同分子分型中表達(dá)差異的根源。在卵巢癌的研究中亦發(fā)現(xiàn)，Reg Ⅳ可能參與腫瘤的形成，而卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與雌激素、孕激素分泌異常有關(guān)［19-22］。筆者推測(cè)，Reg Ⅳ在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用可能和激素或激素受體有關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ER、PR陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后一般較好［23］，對(duì)于HER-2+患者采取靶向治療亦可獲得較好的預(yù)后［24］。RegⅣ與分子分型、生物標(biāo)志物的相關(guān)性可能為其診斷及治療提供幫助。Reg Ⅳ與EGFR無(wú)關(guān)，這與在結(jié)直腸癌中的研究不同［10］，可能是由于組織特異性，或者實(shí)驗(yàn)誤差，抑或Reg Ⅳ的表達(dá)是由多個(gè)通路共同調(diào)控的。

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物與Reg ⅣmRNA表達(dá)的關(guān)系（±s）

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物與Reg ⅣmRNA表達(dá)的關(guān)系（±s）

＊＊P＜0.01

相關(guān)標(biāo)志物ER n Reg ⅣmRNA t+-80 60 2.21±0.52 1.81±0.75 3.581＊＊images/BZ_77_410_793_412_794.pngPR+-62 78 2.22±0.58 1.89±0.69 3.120＊＊HER-2+-55 85 2.38±0.53 1.81±0.64 5.457＊＊Ki-67＜20%≥20%EGFR 46 94 2.13±0.63 1.99±0.67 1.208+-54 86 1.92±0.66 2.11±0.66 1.631

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同臨床病理特征間Reg ⅣmRNA表達(dá)水平的比較（±s）

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同臨床病理特征間Reg ⅣmRNA表達(dá)水平的比較（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與年齡≤40歲比較，P＜0.05

臨床病理特征年齡（歲）≤40 40～60＞60側(cè)別n Reg ⅣmRNA F或t 17 82 41 1.67±0.68 2.08±0.65a 2.11±0.64a 3.103＊＊左右67 73 1.96±0.65 2.10±0.66 1.266腫瘤直徑（cm）≤2＞2 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性陰性組織學(xué)分級(jí)64 76 2.16±0.68 1.94±0.63 1.982＊110 30 2.10±0.66 1.81±0.60 2.179＊52 88 2.07±0.74 2.02±0.61 0.500 1 2 3 16 79 45 2.25±0.60 2.04±0.66 1.95±0.70 1.159

Fig.2 Prognostic significance of Reg ⅣmRNA expression in breast cancer圖2 Reg Ⅳ表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，40歲以上組Reg Ⅳ的表達(dá)高于40歲以下組。Zhong等［25］研究發(fā)現(xiàn)，年輕患者更易復(fù)發(fā)，預(yù)后更差。亦有研究發(fā)現(xiàn)，年輕患者ER、PR 陽(yáng)性率更低，更傾向于預(yù)后差的TNBC 型［26］。Diab 等［27］也認(rèn)為隨著年齡的增加，ER 表達(dá)逐漸增高。考慮Reg Ⅳ與ER、PR的關(guān)系，這可能解釋了Reg Ⅳ在高齡患者中表達(dá)較高，是預(yù)后較好的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Reg Ⅳ高表達(dá)于腫瘤直徑更小、TNM 分期更低的患者中。Shui等［28］發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑小的患者不易發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較好。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)Reg Ⅳ高表達(dá)與良好的生存結(jié)局相關(guān)。結(jié)合Reg Ⅳ與乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物、分子分型和臨床病理特征的關(guān)系，筆者認(rèn)為，乳腺癌患者Reg Ⅳ表達(dá)水平越高，提示患者的預(yù)后越好。