劉云，張曼玲，彭洪嬌，時(shí)昭紅

胃癌是世界上嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，在所有癌癥中其發(fā)病率及死亡率分別為第5 和第3 位［1］。但是，胃癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)的分布并不均勻［2］。所有胃癌病例中有一半以上發(fā)生在東亞、歐洲中東部和中南美洲，尤其在日本和中國(guó)有著較高的發(fā)病率。胃癌起病隱匿，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)進(jìn)入晚期，早期診斷及手術(shù)根治性切除可能性低，術(shù)后5年生存率不足25%［3］。盡管現(xiàn)在臨床上糖類抗原（CA）199、癌胚抗原（CEA）［4］、CA724［5］等腫瘤標(biāo)志物已被廣泛使用，但是其特異度（SPE）及敏感度（SEN）均不理想，且無(wú)法預(yù)測(cè)預(yù)后［6］。目前急需一種新的分子生物標(biāo)志物用于更好地診斷胃癌及判斷預(yù)后。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過(guò)兩外顯子的套索環(huán)化或內(nèi)含子的配對(duì)環(huán)化2種方式形成［7］。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和完善，有關(guān)circRNA 的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤診斷及判斷預(yù)后方面有應(yīng)用前景［8］。多個(gè)研究表明，circRNA 可以作為miRNA 的分子海綿，起到調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控增殖、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程的作用［9-10］。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，circRNAs 在胃癌患者腫瘤組織和血清樣本中表達(dá)失調(diào)，并與臨床病理結(jié)果相關(guān)，提示circRNAs可能是胃癌進(jìn)展中的生物標(biāo)志物［11-13］。鑒于目前缺乏對(duì)circRNA 在胃癌診療中的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，本研究通過(guò)系統(tǒng)回顧和薈萃分析來(lái)評(píng)估低表達(dá)抑癌circRNA 與胃癌診斷及預(yù)后之間聯(lián)系，旨在闡明circRNA 作為診斷胃癌生物標(biāo)志物及判斷預(yù)后的可能性，為臨床決策提供幫助。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 對(duì)PubMed、Embase、Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索2019年6月之前發(fā)表的文獻(xiàn)。檢索策略采用主題詞與自由詞相結(jié)合的方式，檢索式為：“circRNA”或“circular RNA”且“stomach neoplasm”或“gastric neoplasm”或“gnastric cancer”或“stomach cancer”或“GC”，篩 選 流 程見(jiàn)圖1。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有關(guān)circRNA 低表達(dá)的病例對(duì)照研究或隊(duì)列研究。（2）患者被確診為胃癌。（3）文獻(xiàn)內(nèi)容包括關(guān)于circRNA 的表達(dá)、基礎(chǔ)臨床病理參數(shù)、預(yù)后參數(shù)及診斷參數(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）數(shù)據(jù)重復(fù)發(fā)表。（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、會(huì)議摘要、病例報(bào)告及綜述。（3）無(wú)可提取數(shù)據(jù)。（4）非英語(yǔ)文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)提取 3名評(píng)閱人（劉云、張曼玲和彭洪驕）評(píng)估所有錄入文獻(xiàn)，并獨(dú)立對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。此外，第4 名評(píng)閱人（時(shí)昭紅）在出現(xiàn)數(shù)據(jù)矛盾時(shí)解決分歧。數(shù)據(jù)提取內(nèi)容：（1）納入研究的基本特征，包括第一作者、發(fā)表年份、發(fā)表國(guó)家、研究人群來(lái)源、circRNA 名稱、病例數(shù)、檢測(cè)方法。（2）從文中直接提取或運(yùn)用Engauge Digitizer 4.1 軟件從生存曲線上獲取所需數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算獲得總生存期（OS）的風(fēng)險(xiǎn)比，用于預(yù)后分析。（3）在診斷分析中，收集敏感度、特異度和曲線下面積（AUC）。（4）臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等。

1.4 質(zhì)量評(píng)價(jià) 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)根據(jù)Newcastle-Ottawa Scale（NOS）進(jìn)行評(píng)估，如果評(píng)分≥7 分研究被認(rèn)為是高質(zhì)量文獻(xiàn)。本研究符合系統(tǒng)審查和Meta分析（PRISMA）聲明的首選報(bào)告項(xiàng)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用Stata 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。合并優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）用于評(píng)估臨床病理參數(shù)，敏感度、特異度，危險(xiǎn)比（HR）用于評(píng)估OS。使用χ2檢驗(yàn)和I2統(tǒng)計(jì)量評(píng)估研究之間的異質(zhì)性。如果I2值＜50%，則認(rèn)為不存在明顯的異質(zhì)性。當(dāng)存在明顯的異質(zhì)性時(shí)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，否則使用固定效應(yīng)模型。在本研究中，采用隨機(jī)效應(yīng)模型量化合并的敏感度、特異度、診斷優(yōu)勢(shì)比（DOR）、陽(yáng)性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）和AUC，并計(jì)算相應(yīng)的95%CI。進(jìn)一步進(jìn)行敏感性分析，以檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和潛在的異質(zhì)性來(lái)源。漏斗圖、Deeks’圖用于檢測(cè)發(fā)表偏倚。

Fig.1 Flowchart of the study selection process圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索流程及結(jié)果 本次研究在數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到314篇相關(guān)文獻(xiàn)，通過(guò)閱讀全文與摘要，依據(jù)本研究的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出20篇［14-33］合格文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析，其中7 篇文獻(xiàn)用于臨床病理特征分析，9篇文獻(xiàn)可用于預(yù)后分析，16篇文獻(xiàn)用于診斷分析，共計(jì)2 008例研究對(duì)象。

2.2 納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià) 采用NOS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)的方法學(xué)質(zhì)量，該標(biāo)準(zhǔn)包括3 個(gè)方面的評(píng)價(jià)：病例組與對(duì)照組選擇方法、病例組與對(duì)照組的可比性以及接觸暴露評(píng)估方法。評(píng)價(jià)后得分越多質(zhì)量越高，最高為10 分。20 篇文獻(xiàn)中7 篇文獻(xiàn)得分8分，10篇文獻(xiàn)得分7分，3篇文獻(xiàn)得分6分。

2.3 臨床病理參數(shù)Meta 分析 抑癌circRNA 表達(dá)水平降低與較差的臨床病理特征顯著相關(guān)（分化程度：OR=1.33，95%CI：1.14～1.55；TNM 分 期：OR=1.45，95%CI：1.24～1.70；淋巴轉(zhuǎn)移：OR=1.31，95%CI：1.14～1.48；腫瘤大?。篛R=1.28，95%CI：1.06～1.54）；而抑癌circRNA 表達(dá)水平降低與年齡（OR=0.99，95%CI：0.86～1.12）、性 別（OR=0.98，95%CI：0.89～1.08）無(wú)關(guān)。

2.4 預(yù)后Meta分析

2.4.1 預(yù)后Meta 分析文獻(xiàn)的基線特征 預(yù)后Meta分析共納入9 篇文獻(xiàn)，包括10 種circRNA，所有研究均在中國(guó)進(jìn)行。發(fā)表時(shí)間從2017—2019 年。每項(xiàng)研究的樣本量為51～112。此外，均采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)circRNA 的表達(dá)水平，見(jiàn)表1。

Tab.1 The main characteristics of included studies for prognosis analysis表1 納入預(yù)后Meta分析文獻(xiàn)主要臨床數(shù)據(jù)

2.4.2 總生存率Meta 分析結(jié)果 通過(guò)匯總9 篇文獻(xiàn)［17-20,25，30-33］，10 項(xiàng)總生存率數(shù)據(jù)，各研究間無(wú)明顯異質(zhì)性（I2=0，P=0.811），采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析得出抑癌circRNA 高表達(dá)與較好的OS 顯著相關(guān)（HR=0.37，95%CI：0.29～0.48）。見(jiàn)圖2。

Fig.2 Forest plots for overall survival(OS)according to ow-expression of circRNAs圖2 低表達(dá)circRNA總生存期（OS）森林圖結(jié)果

Fig.3 The funnel plot of publication bias of included studies圖3 納入研究文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚漏斗圖

2.4.3 預(yù)后Meta 分析納入文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚和敏感性分析 對(duì)OS繪制漏斗圖評(píng)價(jià)發(fā)表偏倚，其結(jié)果顯示集中趨勢(shì)明顯，不存在發(fā)表偏倚，見(jiàn)圖3；采用敏感性分析檢測(cè)各項(xiàng)研究對(duì)合并HR 的影響，結(jié)果顯示合并后HR的結(jié)果穩(wěn)定性良好，見(jiàn)圖4。

2.5 診斷Meta分析

2.5.1 診斷Meta 分析文獻(xiàn)的基線特征 診斷Meta分析研究的基線特征見(jiàn)表2。診斷Meta分析共納入16篇文獻(xiàn)，包括17種circRNA，所有研究均在中國(guó)進(jìn)行，發(fā)表時(shí)間從2017—2019年。納入研究的樣本量40～254。均采用qRT-PCR 測(cè)量circRNA 的表達(dá)水平，試驗(yàn)組的樣本均來(lái)自胃癌患者；對(duì)照組中，胃組織來(lái)源均為癌旁正常胃組織，此外對(duì)照組血清來(lái)源均來(lái)自正常人群。

2.5.2 診斷Meta 分析結(jié)果 通過(guò)匯總16 篇文獻(xiàn)［14-29］，21 項(xiàng)總診斷數(shù)據(jù)，匯總后的敏感度為0.73（95%CI：0.66～0.79；I2=90.67%），特 異 度 為0.77（95%CI：0.68～0.84；I2=92.69%），AUC 為 0.81（95%CI：0.77～0.84）；此外陽(yáng)性似然比（PLR）為3.13（95%CI：2.32～4.22；I2=84.87%），陰性似然比（NLR）為0.36（95%CI：0.30～0.42；I2=91.74%），DOR 為8.75（95%CI：6.37～12.03；I2=100.0%），見(jiàn)圖5。由于各項(xiàng)匯總數(shù)據(jù)均存在明顯異質(zhì)性，進(jìn)一步用亞組分析來(lái)分析異質(zhì)性來(lái)源，結(jié)果顯示血清circRNA 的診斷效能高于胃癌組織，見(jiàn)表3。

2.5.3 納入診斷Meta 分析文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚 采用Deeks’漏斗圖對(duì)診斷分析各項(xiàng)研究進(jìn)行不對(duì)稱檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)發(fā)表偏倚（P=0.55），見(jiàn)圖6。

Fig.4 The sensitivity analysis of included studies圖4 納入研究文獻(xiàn)的敏感性分析圖

Tab.2 The main characteristics of included studies for diagnosis analysis表2 納入診斷Meta分析文獻(xiàn)主要臨床數(shù)據(jù)

3 討論

目前雖然胃癌的病死率已經(jīng)逐步下降，但是卻對(duì)患者生活質(zhì)量造成了極大的影響［34］，這主要是因?yàn)樵缙谖赴┌Y狀不顯著，常與其他胃腸疾病癥狀相似，因此延誤診治，從而使得大多數(shù)胃癌患者在診斷時(shí)已處于Ⅲ期或Ⅳ期末期階段，不可避免地要進(jìn)行胃切除手術(shù)［35］。而內(nèi)鏡檢查及病理檢查，雖然能及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期胃癌，但由于其不可避免的侵入性及難以忍受的檢查過(guò)程，依然難以在臨床上廣泛開(kāi)展。因此，迫切需要理想的非侵入性生物標(biāo)志物來(lái)加強(qiáng)胃癌檢測(cè)。

目前，有關(guān)尋找新型腫瘤生物標(biāo)志物的大量研究表明，胃癌患者和健康對(duì)照之間微小RNA（miRNA）表達(dá)水平有著明顯差異，提示miRNA 可能在癌癥抑制中起關(guān)鍵作用［36］。Wei 等［37］通過(guò)對(duì)48篇文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析后得出，血清miRNA對(duì)于診斷胃癌的敏感度、特異度以及AUC分別為0.76、0.81以及0.86。隨后長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）的發(fā)現(xiàn)使研究重點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)移，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LncRNA 不僅參與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和凋亡等正常的生理過(guò)程［38］，也在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，不僅能促進(jìn)腫瘤血管生成［39］，還參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程［39］。Hu等［40］通過(guò)對(duì)10篇文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA 診斷胃癌的敏感度為0.63，特異度為0.75，AUC為0.76。

Fig.5 Forest plot of sensitivity and specificity of low-expression of circRNAs for the diagnosis圖5 低表達(dá)circRNA診斷分析敏感度、特異度森林圖

Fig.6 The Deeks’funnel plot of diagnosis of included studies圖6 納入研究文獻(xiàn)的診斷分析Deeks’漏斗圖

Tab.3 Results of subgroup diagnostic Meta-analysis of low-expression of circRNAs表3 低表達(dá)circRNA診斷Meta亞組分析

近年來(lái)circRNA 在癌癥中的重要作用得到了廣泛的認(rèn)可。從2012 年至今，大量研究報(bào)道了circRNA 起源、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能以及其在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)中的作用［9］。同時(shí)，circRNAs作為胃癌生物標(biāo)志物的研究明顯增加。Wang 等［41］初步對(duì)9 種circRNA 在胃癌中的診斷效能進(jìn)行薈萃分析，敏感度、特異度以及AUC 分別為0.73、0.72 以及0.78。鑒于circRNA研究的不斷深入，以及上述Meta分析文獻(xiàn)數(shù)量的局限性，本研究共納入16 篇文獻(xiàn)，17 種circRNA 再次進(jìn)行薈萃分析，探討了抑癌circRNA 作為胃癌診斷生物標(biāo)志物的可行性。薈萃分析結(jié)果顯示：低表達(dá)抑癌circRNA 的診斷敏感度為0.73，特異度為0.77，AUC 為0.81，具有較理想的診斷效能，有望成為胃癌的診斷標(biāo)志物；同時(shí)，筆者還進(jìn)行了亞組分析，在胃癌組織中circRNA 敏感度為0.73，特異度為0.74，AUC 為0.79，而胃癌患者血清circRNA 敏感度為0.73，特異度為0.84，AUC 為0.85，提示與胃癌組織提取的circRNA 相比，血清circRNA 有著較高的診斷效能；同時(shí)，血清circRNA診斷效能接近血清miRNA，由于circRNA 為環(huán)形結(jié)構(gòu)，與miRNA相比，不易被RNA酶降解，具有更好的穩(wěn)定性，因此更易作為一種理想的胃癌檢測(cè)標(biāo)志物。在各項(xiàng)研究中，circ_PSMC3 具有最佳的診斷效能，其敏感度為0.86，特異度為0.95，AUC 為0.93，并且circ_PSMC3 可通過(guò)血液檢查獲得，具有較好的臨床可操作性，可作為胃癌診斷標(biāo)志物在更多的臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

晚期胃癌雖然經(jīng)過(guò)手術(shù)治療，但仍然有40%～65%患者出現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)［42］，因此臨床上同樣需要更好的生物指標(biāo)對(duì)術(shù)后患者預(yù)后做出判斷。本研究評(píng)估了抑癌circRNA作為胃癌生物預(yù)后標(biāo)志物的意義。在臨床病理特征上，抑癌circRNA 的低表達(dá)與較差的臨床病理特征相關(guān)，如腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小。在預(yù)后價(jià)值方面，在研究中共對(duì)9 篇文獻(xiàn)，10 種circRNA 進(jìn)行了薈萃分析，研究結(jié)果提示，低表達(dá)抑癌circRNA 的OS 僅為高表達(dá)抑癌circRNA 患者的37%。此外，本研究中circ_PVRL3［17］、circ_KIAA1244［18］、circ_PSMC3［19］、circ_0000467［20］、circ_0001017［25］、circ_0061276［25］可作為診斷和預(yù)后標(biāo)志物，其中circ_0001017 不但預(yù)示著較差的總生存期（HR=0.29），還具有較好的診斷效能（敏感度=0.76，特異度=0.62，AUC=0.85），是具有臨床意義的胃癌標(biāo)志物。

然而，本研究具有一些局限性：首先，由于circRNA 作為一種較新的非編碼RNA，目前所發(fā)表的文獻(xiàn)依舊不足；此外，同一種circRNA未被不同學(xué)者在多個(gè)研究中驗(yàn)證，因此獲得的數(shù)據(jù)可能存在偏倚；在診斷薈萃分析中存在異質(zhì)性，這可能是由于circRNA 檢測(cè)方法，樣本量大小，樣本病理特征不一等原因造成的，因此需要更詳細(xì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行亞組分析來(lái)解釋異質(zhì)性來(lái)源；其次，納入的研究均為隊(duì)列研究及病例對(duì)照研究，文獻(xiàn)證據(jù)等級(jí)有著一定局限性；最后，本研究?jī)H納入英文文獻(xiàn)，不能排除發(fā)表偏倚。

綜上所述，本研究從Meta 分析角度揭示了低表達(dá)抑癌circRNA與胃癌患者的臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系。低表達(dá)抑癌circRNA可作為一種有效的輔助診斷胃癌的生物標(biāo)志物。本研究的結(jié)論仍需高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)證實(shí)。