武迎春 苗蘭寧 謝添羽 郝光飛 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 河北邯鄲 056000

引言

高山被孢霉是一種多產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸的產(chǎn)油絲狀真菌，經(jīng)過大量的研究，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)證實了其對人體的安全性。多不飽和脂肪酸受到越來越廣泛的關(guān)注，不僅因為其是人體不可缺少的必需脂肪酸，還因為它們在人體生理中起著極其重要的代謝作用，與許多現(xiàn)代疾病的發(fā)生和調(diào)節(jié)密切相關(guān)。幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者們對脂質(zhì)累積的調(diào)節(jié)進行了研究，發(fā)現(xiàn)NADPH是關(guān)鍵影響因素，主要為脂肪酸合成過程提供還原力。

1 NADPH主要來源基因的比較

1.1 糖酵解途徑產(chǎn)NADPH的相關(guān)酶研究

隨著研究的不斷深入，學(xué)者們確定了脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶基因。研究表明，糖酵解途徑中的蘋果酸酶（ME）是高山被孢霉合成脂肪酸的主要限速步驟，進行蘋果酸到丙酮酸的不可逆脫羧反應(yīng)，為脂肪酸鏈延長過程提供了大量的還原力 NADPH，其已經(jīng)得到充分認證和研究。研究表明，ME基因表達的增加會導(dǎo)致脂肪酸生物合成的增加和不飽和脂肪酸的形成。同時，脂肪積累需要對照菌株亮氨酸生物的合成途徑。

1.2 磷酸戊糖途徑產(chǎn)NADPH的相關(guān)酶研究

圖1 基因每上調(diào)50%菌株中NADPH含量變化

圖2 基因每上調(diào)50%菌株中脂肪酸含量變化

糖酵解代謝的另外一種常見途徑即磷酸戊糖途徑，不僅能為合成代謝提供多種原料，而且為脂肪酸合成提供了大量的還原力NADPH。磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）被證明是脂肪酸合成的主要限速酶基因。結(jié)果表明，G6PD2對脂肪酸合成及還原力NADPH的合成影響最為顯著，6PGD作為磷酸戊糖途徑的另一關(guān)鍵酶對脂肪酸合成發(fā)揮了重要作用[1]。

1.3 三羧酸循環(huán)產(chǎn)NADPH的相關(guān)酶研究

三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生NADPH的異檸檬酸脫氫酶（IDH）通過提供所需的輔助因子NADPH在脂肪和膽固醇的生物合成中發(fā)揮著重要的作用。2019年，孫曉琪等對異檸檬酸脫氫酶（IDH）進行了過表達，探究了其對高山被孢霉脂肪酸含量的影響。在氮源限制條件下，過表達IDH4/5/6可以顯著提高高山被孢霉中NADPH的含量，分別提高37.6%、46.2%和30.1%[2]。

1.4 氨基酸代謝相關(guān)酶基因產(chǎn)NADPH的研究

研究表明，氨基酸代謝對微生物脂肪酸合成具有非常重要的影響，比如提供所需還原力NADPH、乙酰輔酶A等[3]。研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽分解代謝、脂肪酸β氧化、亮氨酸代謝和賴氨酸降解為生物合成脂肪酸發(fā)揮了重要作用。除此之外，葉酸代謝和四氫生物蝶呤代謝過程中會產(chǎn)生大量的NADPH，而這恰好是脂肪酸合成所必須的[4]。

1.5 產(chǎn)NADPH主要來源基因的比較

NADPH作為脂肪酸合成過程中所需還原力的唯一來源，是脂肪酸合成的關(guān)鍵因素。本文以多篇文獻結(jié)果為依據(jù)，對其在高山被孢霉中同源過表達菌株實驗結(jié)果進行整理，化為等比后進行結(jié)果比較，如圖1、圖2所示。

當(dāng)對關(guān)鍵酶基因進行同源過表達時，不同基因過表達菌株的NADPH含量及脂肪酸含量變化有明顯差異。其中苯丙氨酸羧化酶（PAH）過表達菌株中NADPH有最大程度的增加（P＜0.001），當(dāng)基因上調(diào)50%時，PAH過表達菌株中NADPH增加為對照菌株的5.63倍。相比較之下，亞甲基四氫葉酸脫氫酶（MTHFD）過表達菌株中脂肪酸含量有最大程度的增加（P＜0.001），增加為對照菌株的3.08倍。

值得注意的是，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD2）無論是NADPH含量還是脂肪酸含量都發(fā)生了極顯著性的變化。當(dāng)基因上調(diào)50%時，其NADPH含量增加為對照菌株的2.78倍，脂肪酸含量增加為對照菌株的2.45倍。由以上結(jié)果可知，產(chǎn)NADPH能力和產(chǎn)脂肪酸能力沒有絕對關(guān)系，但大多數(shù)趨勢一致。高NADPH產(chǎn)量也伴隨著高脂肪酸產(chǎn)量，相反低NADPH產(chǎn)量也伴隨著低脂肪酸產(chǎn)量。

結(jié)語

綜上所述，氨基酸代謝及磷酸戊糖代謝過程所產(chǎn)生的NADPH為高山被孢霉脂肪酸合成還原力的主要來源，約占89%。過表達菌株NADPH的增加明顯促進了脂肪酸含量的增加，這再一次證明了NADPH對于脂肪酸合成具有非常重要的作用，是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵控速步驟。

本文通過對脂肪酸合成過程中供給NADPH的主要來源基因進行了比較，對不同的酶基因效率進行了分析，強調(diào)了NADPH對于脂肪酸合成的重要性，為構(gòu)建多產(chǎn)脂肪酸工程菌株提供了理論依據(jù)，這對產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。