HPLC-DAD 法研究雷公藤煨制后化學(xué)成分變化*

★ 劉建群 羅素花 楊瑞昆 閆君 舒積成 張銳

（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

雷 公 藤（Triptergium wilfordii Hook.f.）系 衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，含有二萜、三萜、生物堿等類化學(xué)成分，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種活性［1］。雷公藤在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、銀屑病等自身免疫性疾病方面效果顯著［2］。雷公藤及其有效成分雷公藤甲素、雷公藤紅素及生物堿等毒副作用較大，雷公藤是不良反應(yīng)報道最多的中草藥之一，這大大限制其臨床應(yīng)用［3-5］。有毒中藥一直是中藥炮制研究的重點，《神農(nóng)本草經(jīng)》云“有毒宜制”。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)雷公藤經(jīng)200℃烘箱煨制后有顯著的減毒增效作用［6-7］，而雷公藤經(jīng)微波煨制后雖然毒性顯著下降，但是基本喪失了抗炎活性［7-8］。我們還總結(jié)了炮制對雷公藤毒效及其化學(xué)成分的影響，研究表明應(yīng)加強(qiáng)較有前景的雷公藤煨制、米醋蒸和萊菔子汁制炮制的深入研究，加強(qiáng)雷公藤炮制傳統(tǒng)理論研究，炮制對雷公藤的性味、歸經(jīng)和功能主治的影響研究等［9］。為闡明雷公藤煨制減毒增效物質(zhì)基礎(chǔ)，提高雷公藤臨床應(yīng)用的安全性，我們采用紫外分光光度法測定了雷公藤200℃烘箱煨制后化學(xué)成分含量變化，結(jié)果表明煨制后總二萜、總?cè)坪涂偵飰A的含量顯著下降，其中總生物堿降幅最大［10］。采用UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)結(jié)合主成分分析鑒定了煨制后發(fā)生顯著變化的35 個成分，其中大部分是生物堿，其次是三萜［11］。為進(jìn)一步闡明雷公藤煨制減毒增效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文采用HPLC-DAD 方法對雷公藤煨制后化學(xué)成分的變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析鑒定。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料 雷公藤藥材采自江西省萍鄉(xiāng)市，原植物經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤（Triptergium wilfordii Hook.f.）。

甲醇（色譜純，DIKMA 公司），甲酸（色譜純，阿拉丁公司），乙腈（色譜純，ACS 公司），雙蒸水（自制），其他試劑均為分析純。對照品雷公藤次堿、雷公藤吉堿、去甲澤拉木醛和雷公藤紅素（含量均大于98%，鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司），對照品南蛇藤肉桂酰胺堿、1-羥基-2， 5， 8-三甲基-9-芴酮、25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide 和雷公藤定堿（本實驗室分離制得，經(jīng)HPLC 檢測含量均大于98%）。

1.2 實驗儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（Agilent 公 司）；BT25S 型 電 子 天 平（1/10 萬，Sartorius）；BS224S 型電子天平（1/1 萬，Sartorius）；GZX-9140 MBF 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；PS-40 潔康超聲儀（東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 雷公藤藥材及其煨制品溶液的制備 稱取雷公藤根藥材2 份，每份10g，分為生品組和200℃煨制品組。煨制品按以下方法制備：取黃土?xí)窀裳心ズ筮^4 號篩，與10%食鹽水按每4g 黃土中加入1ml 食鹽水的比例和勻，將錫箔紙包住的10g 藥材用黃泥均勻包裹，包層厚度約3mm，置于200℃的烘箱中煨制45min，取出，剝離黃泥，得8.7g 雷公藤煨制品。將10g 雷公藤生品和8.7g 的雷公藤煨制品粉碎，分別用100ml甲醇超聲提取30min，靜置，取上清液1ml，過0.22um 有機(jī)濾膜，得生品組和煨制品組樣品溶液。

2.1.2 雷公藤總生物堿及其煨制品溶液的制備 精密稱取雷公藤藥材（粉碎過三號篩）約40g。加95%乙醇700ml，超聲提取30min，取出，濾過，濾液減壓蒸干。殘渣加鹽酸溶液（1 →100）300ml 溶解，濾過。濾液加10ml 濃氨水試液調(diào)節(jié)pH 值至9，用乙醚400ml 振搖萃取，乙醚液揮干，得到總生物堿。精密稱取總生物堿2 份，每份12mg。一份用10ml甲醇溶解，過0.22um 有機(jī)濾膜，得總生物堿樣品溶液。另一份按照上述“2.1.1”方法煨制后，再用10ml 甲醇溶解，過0.22um 有機(jī)濾膜，得總生物堿煨制品溶液。

2.1.3 雷公藤紅素及其煨制品溶液的制備 精密稱取雷公藤紅素對照品兩份，每份13mg。一份用10ml 甲醇溶解，過0.22um 有機(jī)濾膜，得雷公藤紅素樣品溶液。另一份按照上述“2.1.1”方法煨制后，再用10ml 甲醇溶解，過0.22um 有機(jī)濾膜，得雷公藤紅素煨制品溶液。

2.1.4 混合對照品溶液的制備 精密稱取雷公藤次堿，雷公藤吉堿，雷公藤定堿對照品適量，分別用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為30μg/mL 的混合對照品溶液1。精密稱取南蛇藤肉桂酰胺堿，25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide，去甲澤拉木醛， 1-羥基-2，5，8-三甲基-9-芴酮，用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為30μg /mL 的混合對照品溶液2。

2.2 HPLC-DAD 測定條件 色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈，洗脫條件為：0 - 20min、5% →25%B；20 -60min、25% →80%B；60-85min、80%→80%B；85-87min、80%→100%B；87-90、100%→100%B；流速1ml/min；進(jìn)樣量30μL；柱溫30℃；DAD 檢測器，檢測波長254nm。

2.3 樣品測定及數(shù)據(jù)分析

2.3.1 HPLC-DAD 測定及數(shù)據(jù)分析 取“2.1.1～2.1.4”制備好的雷公藤藥材、總生物堿、雷公藤紅素及其煨制品溶液，混合對照品溶液，按照“2.2”測定條件進(jìn)行HPLC-DAD 分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-DAD 檢測結(jié)果 雷公藤藥材，總生物堿，雷公藤紅素生品及其煨制品HPLC-DAD 分析結(jié)果見圖1。由圖1 可見：雷公藤煨制后化學(xué)成分含量發(fā)生了顯著變化，還新產(chǎn)生一些成分。根據(jù)對照品對照結(jié)合DAD 光譜鑒定的雷公藤煨制前后22 種顯著性差異化合物信息見表1，其中確定結(jié)構(gòu)的化合物8 種。由圖1 和表1 可見：雷公藤煨制后，南蛇藤肉桂酰胺堿，雷公藤定堿，雷公藤吉堿，雷公藤次堿，去甲澤拉木醛，雷公藤紅素等10 種成分含量顯著降低；新產(chǎn)生成分12 種，來源于雷公藤紅素的煨制產(chǎn)物10 種，為1-羥基-2， 5， 8-三甲基-9-芴酮，25（9 →8），26（13 →14）Abeo-24-nor-8，14-seco-friedelan-2，3-dihydroxy-1，3，5（10），6，8-pentaen-29（13）-olide 等化合物，來源于睛瞇類生物堿的煨制產(chǎn)物2 種。HPLC-DAD 分析結(jié)果進(jìn)一步表明，生物堿、去甲澤拉木醛和雷公藤紅素的變化可能是雷公藤煨制減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 HPLC-DAD 紫外圖譜 根據(jù)HPLC-DAD 測得的22 種成分紫外圖譜進(jìn)行類型和來源鑒定，代表性DAD 紫外圖譜見圖2。圖1 中“1，1’，12’”三種成分的紫外吸收光譜類似，與睛瞇類生物堿紫外吸收光譜相似?！?’～11’”紫外吸收光譜類似，再對比雷公藤紅素煨制前后HPLC 圖譜?？膳袛嗥淇赡芫鶃碓从诶坠偌t素，且是同一類化合物?！?，6，8”三種成分采用對照品鑒別為倍半萜類生物堿?！?，3，4，7”四種成分紫外圖與倍半萜類生物堿相似，可能為倍半萜類生物堿。“2’，4’ ”還不能確定其結(jié)構(gòu)類型，但是它們也來源于雷公藤紅素，有待于進(jìn)一步研究。

圖1 HPLC圖譜

圖2 鑒定的代表性成分DAD紫外圖譜

4 結(jié)論

本文采用HPLC-DAD 技術(shù)對雷公藤生品及其煨制品中的化學(xué)成分進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)雷公藤煨制后有22 種化學(xué)成分變化顯著。結(jié)合對照品及文獻(xiàn)對這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，共鑒定了8 個化合物的結(jié)構(gòu)，這些化合物大部分是生物堿，其次是三萜，其中南蛇藤肉桂酰胺堿，雷公藤定堿，雷公藤吉堿，雷公藤次堿，去甲澤拉木醛，雷公藤紅素等10 種成分含量顯著降低。新產(chǎn)生成分12 種，包括來源于雷公藤紅素的煨制產(chǎn)物10 種，來源于睛瞇類生物堿的煨制產(chǎn)物2 種。生物堿、去甲澤拉木醛和雷公藤紅素均為雷公藤抗炎有效成分，用時又是毒性較大的成分［12-14］。因此生物堿、去甲澤拉木醛和雷公藤紅素的變化可能是雷公藤煨制減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果基本吻合［10-11］，進(jìn)一步確定了生物堿和雷公藤紅素的變化是雷公藤煨制減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為雷公藤煨制機(jī)理研究奠定了堅實基礎(chǔ)。