吳曉軍，胡喜貴，陳向東，姜小苓，胡鐵柱，李笑慧，程 威，茹振鋼

(河南科技學(xué)院 小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

基于染色體消失法的小麥×玉米誘導(dǎo)單倍體技術(shù)，具有對(duì)可交配性基因Kr不敏感的優(yōu)點(diǎn)，不同基因型小麥均能夠獲得單倍體植株[1]，是目前小麥單倍體的主要產(chǎn)生方式之一，已越來(lái)越多地應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外小麥育種中[2-3]。

由于小麥與玉米的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雜交穗籽粒沒(méi)有胚乳，導(dǎo)致單倍體幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育得不到正常營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，需要及時(shí)進(jìn)行離體培養(yǎng)以保證其存活。影響小麥單倍體胚離體培養(yǎng)效果的因素較多。在小麥植株生長(zhǎng)階段，激素處理、環(huán)境因素、基因型及基因型對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等均會(huì)影響單倍體胚的產(chǎn)生及生長(zhǎng)發(fā)育狀況[4-8]。其中，最主要的因素是適宜小麥植株及雜交穗生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境條件。在離體培養(yǎng)階段，胚拯救的時(shí)機(jī)、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境條件等因素也會(huì)影響單倍體胚的成苗率[4-10]。其中，胚拯救的時(shí)機(jī)是影響成苗率最關(guān)鍵的因素，其次是支持未成熟胚繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育直至成苗的培養(yǎng)基成分[11]。小麥單倍體胚離體培養(yǎng)多以MS、1/2MS或B5等為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)添加激素、蔗糖和其他營(yíng)養(yǎng)成分形成不同類型的培養(yǎng)基，而且一般多為一次成苗培養(yǎng)基[3,12-13]。

不同基因型小麥與玉米雜交后均能獲得單倍體胚，但得胚率差異較大。目前，關(guān)于單倍體育種技術(shù)研究主要集中于高效培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)基成分改進(jìn)、激素組成及配比分析等方面[3,12-13]。而對(duì)于培養(yǎng)基及生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)單倍體胚萌發(fā)及成苗的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)添加谷氨酰胺、激素等進(jìn)行培養(yǎng)基改進(jìn)，并對(duì)來(lái)源于大田、盆栽和離體培養(yǎng)的小麥單倍體胚進(jìn)行培養(yǎng)，明確培養(yǎng)基添加物質(zhì)對(duì)不同環(huán)境來(lái)源小麥單倍體胚發(fā)育的促進(jìn)作用，進(jìn)而篩選出適合不同基因型小麥材料的通用型培養(yǎng)基，以穩(wěn)定提高小麥單倍體胚的成苗率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用小麥材料為由多個(gè)黃淮麥區(qū)小麥品種構(gòu)建的矮敗輪選群體不育單株(Rss1)，種植于新鄉(xiāng)市河南科技學(xué)院小麥中心朗公廟鎮(zhèn)試驗(yàn)基地，其中一部分種植于花盆內(nèi)；2個(gè)單交組合F1百農(nóng)4199×云南麥(C1F1)和百農(nóng)4199×矮05(C2F1)，種植于花盆內(nèi)，所有小麥材料均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。父本材料為水果玉米甜脆蜜9號(hào)，購(gòu)自北京金土地農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所，種植于日光溫室內(nèi)。

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為MC1、MC2、MC3。MC1：1/2MS(大量元素減半)+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH值5.8。MC2：1/2MS+50 mg/L維生素C+150 mg/L谷氨酰胺+20 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH值5.8。MC3：1/2MS+0.5 mg/L IAA(Indole-3-acetic acid)+0.5 mg/L KT(Kinetin)+150 mg/L谷氨酰胺+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH值5.8。

離體培養(yǎng)液為1/2 MS(含大量和微量元素)+8 mL/L 亞硫酸+20 g/L蔗糖。

1.2 材料種植、雜交

Rss1種植于大田及花盆，C1F1、C2F1種植于花盆中，玉米分期種植于溫室內(nèi)。C1F1、C2F1使用常規(guī)方法去雄整穗，Rss1花藥敗育只需剪穎即可，整穗后及時(shí)套袋，掛上標(biāo)簽。采集新鮮玉米混合花粉在9:00—11:00對(duì)小麥進(jìn)行授粉。Rss1授粉后繼續(xù)生長(zhǎng)于大田環(huán)境，選取其中15個(gè)雜交穗保留莖稈沿著地面剪掉，進(jìn)行離體培養(yǎng)。生長(zhǎng)于花盆內(nèi)的Rss1、C1F1和C2F1授粉后繼續(xù)在花盆中生長(zhǎng)直至剪穗。授粉后24 h和48 h進(jìn)行穗部激素處理，處理液為2，4-D(100 mg/L)和二甲基亞砜(20 mL/L)的混合溶液，噴施處理需確保每個(gè)小穗雌蕊都能接觸到激素溶液。

離體培養(yǎng)具體步驟：選取生長(zhǎng)于大田的15穗Rss1,在授粉24 h后割穗并立即進(jìn)行第1次激素噴穗處理，放入離體培養(yǎng)液中，在人工培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行離體培養(yǎng)(16 h光照，濕度75%)，授粉48 h后進(jìn)行第2次激素噴施，以后每3 d更換1次離體培養(yǎng)液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在授粉后16 d，取大田、盆栽雜交穗，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行籽粒表面滅菌1 min，無(wú)菌水沖洗1～2次，接著用0.1%升汞溶液滅菌10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，每次20 s，同時(shí)不停攪拌。在解剖鏡下剝出幼胚，接種于培養(yǎng)基上。接種后培養(yǎng)基先在4 ℃冰箱中處理2～3 d，然后置于組織培養(yǎng)室23 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，再置于23 ℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)至出苗。在授粉后15 d，取15個(gè)Rss1離體培養(yǎng)雜交穗，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行剝胚和接種操作(方法同上)。

將大田、盆栽及離體培養(yǎng)Rss1獲得的單倍體胚接種于MC1培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3次重復(fù)，分析不同環(huán)境來(lái)源小麥單倍體胚的培養(yǎng)效果。將大田(Rss1)和盆栽(C1F1和C2F1)小麥材料獲得的單倍體胚分別接種于MC1、MC2和MC3培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3次重復(fù)，分析不同培養(yǎng)基對(duì)小麥單倍體胚萌發(fā)及成苗的影響。

接種15～25 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)、成苗數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率、成苗率。統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)時(shí)設(shè)定統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：至少明顯有1～2片葉、植株高2～3 cm以上且至少長(zhǎng)出1條根。

得胚率=接種胚數(shù)/授粉小花數(shù)×100%;

萌發(fā)率=萌發(fā)胚數(shù)/接種胚數(shù)×100%;

成苗率=成苗數(shù)/接種胚數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境來(lái)源小麥單倍體胚在MC1培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果

小麥×玉米的雜交穗經(jīng)離體培養(yǎng)一般13～16 d可剝胚，絕大部分籽粒飽滿且持綠正常，中大胚率較高，胚形態(tài)較完整。大田生長(zhǎng)的雜交穗一般需要生長(zhǎng)16 d以上可剝胚，衰枯籽粒較多，占40%以上，中大胚率較離體培養(yǎng)低，且大胚易出現(xiàn)畸形和完整度低的現(xiàn)象。盆栽雜交穗一般也需要生長(zhǎng)16 d以上可剝胚，衰枯籽粒占30%以上，中小胚較多，大胚較少。大田生長(zhǎng)、盆栽和離體培養(yǎng)結(jié)果(表1)顯示，Rss1雜交穗在大田中生長(zhǎng)，得胚率僅為2.2%；盆栽得胚率為5.3%；而雜交穗離體培養(yǎng)的得胚率達(dá)到8.4%，幾乎是大田條件下的4倍，且接種到MC1培養(yǎng)基上，單倍體胚的萌發(fā)率和成苗率分別為81.5%和63.0%，比大田條件下提高60.1%和3.4倍，比盆栽高出30.4%和68.0%。表明提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，獲得發(fā)育程度適宜的幼胚是提高單倍體胚萌發(fā)率和成苗率的關(guān)鍵。

表1 不同環(huán)境來(lái)源小麥單倍體胚的培養(yǎng)效果Tab.1 Culture effect of wheat haploid embryos from different environments

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫(xiě)字母表示不同材料間差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05),下同。
Note:The different uppercase,lowercase letters after data within a column mean significant differences among different treatments at 0.01,0.05 levels,respectively;the same below.

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)小麥單倍體胚萌發(fā)及成苗的影響

由表2可以看出，在MC1培養(yǎng)基中，小麥單倍體胚萌發(fā)率表現(xiàn)為Rss1>C2F1>C1F1，其中，Rss1高達(dá)50.9%，C1F1僅為16.7%；成苗率表現(xiàn)為C2F1>Rss1>C1F1，其中，C2F1高達(dá)27.8%，C1F1僅為8.3%。在MC2培養(yǎng)基中，小麥單倍體胚萌發(fā)率表現(xiàn)為Rss1>C1F1>C2F1，其中，Rss1高達(dá)62.2%，C2F1僅為25.0%；成苗率表現(xiàn)為Rss1>C1F1>C2F1，其中，Rss1高達(dá)32.4%，C2F1僅為16.7%。在MC3培養(yǎng)基中，小麥單倍體胚萌發(fā)率表現(xiàn)為C2F1>C1F1>Rss1，其中，C2F1高達(dá)85.2%，Rss1僅為53.8%；成苗率表現(xiàn)為C1F1>C2F1>Rss1，其中，C1F1高達(dá)80.8%，Rss1僅為25.6%。

由表2可以看出，共接種小麥單倍體胚418個(gè)，萌發(fā)211個(gè)，平均萌發(fā)率50.5%，成苗105株，平均成苗率25.1%。不同培養(yǎng)基上小麥單倍體胚的平均萌發(fā)率表現(xiàn)為MC3>MC2>MC1，MC1培養(yǎng)基與MC2培養(yǎng)基差異不顯著，MC3培養(yǎng)基與MC1、MC2培養(yǎng)基間差異均達(dá)到極顯著水平；平均成苗率表現(xiàn)為MC3>MC2>MC1，MC2培養(yǎng)基與MC1培養(yǎng)基間差異顯著，MC3培養(yǎng)基與MC2、MC1培養(yǎng)基間差異均極顯著。MC1培養(yǎng)基的平均萌發(fā)率(42.3%)和平均成苗率(15.3%)均最低，MC3培養(yǎng)基平均萌發(fā)率(65.6%)和平均成苗率(38.2%)均最高。

表2 不同培養(yǎng)基上小麥單倍體胚的萌發(fā)和成苗情況Tab.2 Embryo germination and plantlet regeneration on three different media

注：同列小計(jì)數(shù)據(jù)之間單獨(dú)進(jìn)行差異顯著性比較。
Note:The significances of difference of subtotal data were compared separately.

不同培養(yǎng)基上的小麥單倍體幼苗的生長(zhǎng)情況如圖1所示，在不添加激素的MC1培養(yǎng)基上，小麥單倍體胚萌發(fā)時(shí)間一般為7～10 d，能夠一次培養(yǎng)成苗，但平均萌發(fā)率和平均成苗率均最低。在添加了150 mg/L谷氨酰胺和50 mg/L維生素C的MC2培養(yǎng)基上，小麥單倍體胚經(jīng)過(guò)近1個(gè)月培養(yǎng)，產(chǎn)生了質(zhì)量較高的愈傷組織，能夠直接分化出叢生苗，根系健壯，長(zhǎng)勢(shì)好。在添加激素(0.5 mg/L IAA和0.5 mg/L KT)和150 mg/L谷氨酰胺的MC3培養(yǎng)基上，小麥單倍體胚萌發(fā)時(shí)間一般為7～15 d，較MC1培養(yǎng)基晚，較MC2培養(yǎng)基早；培養(yǎng)3 d后單倍體胚小幅膨大，在未形成愈傷前直接分化出苗，幼苗生長(zhǎng)速度快，但一般較細(xì)弱，根也較細(xì)短或無(wú)根，大部分無(wú)法一次培養(yǎng)成苗，需轉(zhuǎn)移至添加多效唑的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行促根壯苗培養(yǎng)。

A為MC1培養(yǎng)基，B為MC2培養(yǎng)基，C為MC3培養(yǎng)基A is MC1 medium，B is MC2 medium，C is MC3 medium圖1 不同培養(yǎng)基上的小麥單倍體幼胚成苗情況Fig.1 Seedlings regeneration of wheat haploid immature embryos on different media

在本試驗(yàn)中，由于大田環(huán)境不利氣候的影響，Rss1的單倍體胚發(fā)育狀況普遍較差，畸形胚和小胚較多，影響了其在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果，在MC2培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果最好，其次是MC3培養(yǎng)基，在MC1培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果較差。2個(gè)小麥組合C1F1和C2F1在盆栽營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不充裕的情況下，獲得的多為中小胚和發(fā)育不良幼胚，其在添加激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的MC3培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果最好。綜合以上結(jié)果，在單倍體幼胚發(fā)育狀況不佳的情況下，添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或激素的1/2MS培養(yǎng)基能夠獲得相對(duì)于1/2MS培養(yǎng)基更好的培養(yǎng)效果。

2.3 不同小麥材料的單倍體胚萌發(fā)及成苗情況

不同小麥材料的平均萌發(fā)率和平均成苗率如表3所示，萌發(fā)率以小麥組合C2F1最高，達(dá)到54.0%；Rss1次之，為53.7%；C1F1最低，為40.4%。成苗率以C1F1最高，達(dá)到32.7%；C2F1次之，為26.4%；Rss1最低，為21.1%。綜合來(lái)看，小麥組合C1F1的成苗率最高，Rss1最低。

表3 不同小麥材料單倍體胚的萌發(fā)和成苗差異Tab.3 Diversity of embryo germination and plantlet regeneration frequency in different wheat materials

3 結(jié)論與討論

在云南省昆明市自然條件下小麥材料播期為3月下旬到8月上旬，花期為5月上旬到10月上旬，期間均可以與大田玉米的花期相遇[7]，得天獨(dú)厚的地理環(huán)境及氣候?yàn)樾←渾伪扼w技術(shù)的低成本全年大規(guī)模利用創(chuàng)造了條件。而在黃淮及華北地區(qū)，大田條件下小麥的適宜授粉時(shí)間約為1個(gè)月，一般在4—5月[8,13]。因此，在自然條件下這些地區(qū)的單倍體育種利用受到限制，需要提供其他設(shè)施條件以延長(zhǎng)授粉時(shí)間，人力物力成本相對(duì)較高，不利于該地區(qū)單倍體育種技術(shù)的規(guī)?；l(fā)展。

研究表明，小麥單倍體胚誘導(dǎo)的最佳溫度為白天22 ℃、夜晚17 ℃[13]；在云南省昆明市自然條件下，授粉后進(jìn)行澆灌能夠提高小麥單倍體胚誘導(dǎo)率，并且小麥結(jié)實(shí)飽滿[7]。河南科技學(xué)院小麥中心品種創(chuàng)新課題組連續(xù)多年的小麥單倍體育種實(shí)踐表明，在河南省新鄉(xiāng)市大田條件下進(jìn)行小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體胚的效率非常低，一般得胚率只有1%～3%，究其原因主要是近年來(lái)極端天氣頻發(fā)和普通年份高溫少雨導(dǎo)致的。眾多學(xué)者對(duì)小麥雜交穗易遭受復(fù)雜多變環(huán)境因素影響的問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，提出采用雜交穗離體培養(yǎng)的方法來(lái)避免環(huán)境干擾，近年來(lái)也獲得了較大的研究進(jìn)展[8,14-16]。顧堅(jiān)等[16]在云南昆明進(jìn)行的雜交穗離體培養(yǎng)得胚率一般是田間自然生長(zhǎng)的3倍以上，本研究也得出類似結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，在大田生長(zhǎng)的小麥植株相比于溫室和盆栽分蘗更多且更加健壯，在花期與玉米授粉后割取雜交穗進(jìn)行離體培養(yǎng)，一般12～16 d就可以剝?nèi)伪扼w幼胚，時(shí)間短，人力投入集中，是一種在該地區(qū)較為經(jīng)濟(jì)、高效和易于規(guī)?；膯伪扼w育種方式。

小麥單倍體胚培養(yǎng)一般以B5和MS及其衍生培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與添加了谷氨酰胺和維生素C的MC2培養(yǎng)基相比，未添加其他成分的MC1培養(yǎng)基中小麥單倍體胚的平均萌發(fā)率無(wú)顯著差異，而平均成苗率顯著降低；與添加了IAA和KT的 MC3培養(yǎng)基相比，未添加其他成分的MC1培養(yǎng)基中小麥單倍體胚的平均萌發(fā)率和成苗率均極顯著降低。目前，關(guān)于添加激素對(duì)小麥單倍體胚萌發(fā)和成苗的影響研究結(jié)論不一。陳新民等[8,18]研究表明，1/2MS培養(yǎng)基中小麥單倍體胚成苗率顯著高于Taira-Larter(TL)培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基與1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果差異不明顯，一次培養(yǎng)成苗率均較高，能夠達(dá)到70%～80%；并且認(rèn)為1/2MS培養(yǎng)基加入一定濃度的激素IAA和KT也能夠達(dá)到較好的培養(yǎng)效果，這與本研究結(jié)果類似。然而，來(lái)長(zhǎng)凱[19]研究表明，1/2MS培養(yǎng)基中小麥單倍體胚萌發(fā)率能夠達(dá)到86.5%，略高于添加了激素成分的1/2MS培養(yǎng)基，成苗率顯著高于添加激素的培養(yǎng)基，這與本研究結(jié)果相反。蔡?hào)|明[20]在1/2MS培養(yǎng)基中添加激素成分，結(jié)果顯示，小麥單倍體幼胚萌發(fā)率達(dá)到了92.2%，而1/2MS培養(yǎng)基上小麥單倍體幼胚并未萌發(fā)。趙翠榮等[21]認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的激素能夠促進(jìn)一些發(fā)育狀況不佳幼胚的發(fā)育，但卻抑制發(fā)育成型幼胚的萌發(fā)和生長(zhǎng)。造成這種差異的原因可能有以下2個(gè)方面：一是小麥材料的遺傳背景差異會(huì)影響單倍體胚誘導(dǎo)形成和分化能力，造成一些小麥材料單倍體胚的誘導(dǎo)或培養(yǎng)效果不理想，或者只在特定培養(yǎng)基上才具有較好的培養(yǎng)效果；二是接種時(shí)的單倍體胚發(fā)育狀況不同，如在田間條件下雜交穗受到不利天氣影響造成單倍體胚的發(fā)育緩慢、畸形，雜交穗的上部穗位會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的小胚等，這些胚在未添加激素的1/2MS培養(yǎng)基上難以分化，易產(chǎn)生玻璃化苗，培養(yǎng)效果不理想，而在添加代謝途徑重要物質(zhì)或激素成分的培養(yǎng)基上，能夠繼續(xù)生長(zhǎng)完善，從而提高分化能力。在本研究中，小麥材料Rss1種植于大田環(huán)境中，由于該地區(qū)的高溫少雨天氣非常不利于單倍體胚誘導(dǎo)形成和生長(zhǎng)，造成了一方面雜交穗的結(jié)實(shí)率較低(60%～70%)，另一方面獲得的發(fā)育不良的單倍體胚較多，因此,在不添加激素和其他營(yíng)養(yǎng)成分的1/2MS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果較差，而在其他2種培養(yǎng)基上能夠獲得相對(duì)更好的培養(yǎng)效果。2個(gè)盆栽雜交組合F1，在遭遇高溫或低溫天氣時(shí)可以隨時(shí)搬入智能溫室躲避，畸形胚較少，但受限于植株?duì)I養(yǎng)供應(yīng)不足，獲得的胚一般都較小，在1/2MS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果也較一般。小麥雜交組合C2F1對(duì)培養(yǎng)基具有選擇性,在MC2培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果反而不如MC1培養(yǎng)基。綜合來(lái)看，加入激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的MC3培養(yǎng)基對(duì)不同小麥基因型材料都具有較好的培養(yǎng)效果，能夠促進(jìn)發(fā)育狀況不佳單倍體幼胚的生長(zhǎng)和分化，但一次培養(yǎng)成苗率較低，需要在出苗后及時(shí)更換培養(yǎng)基，進(jìn)行促根壯苗培養(yǎng)。

本研究結(jié)果表明，添加其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素成分的1/2MS培養(yǎng)基能夠促進(jìn)小胚和發(fā)育不良幼胚的生長(zhǎng)和分化，提高萌發(fā)率和成苗率。在進(jìn)行單倍體育種實(shí)踐時(shí)，可根據(jù)對(duì)當(dāng)年獲得總胚數(shù)和幼胚質(zhì)量的預(yù)測(cè)，提前制備一定比例的1/2MS通用培養(yǎng)基和MC3培養(yǎng)基，以滿足不同質(zhì)量單倍體幼胚的培養(yǎng)要求，提高成苗率。下一步將繼續(xù)研究小麥材料生長(zhǎng)和雜交穗發(fā)育的適宜環(huán)境條件，優(yōu)化適宜該地區(qū)的單倍體育種方法。