黃曉潤(rùn)，郭婭，黎忠杰，曾金興，吳擁軍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

水豆豉是以大豆為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、制曲、發(fā)酵等工藝加工而成[1]，具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值的豆制品[2]。水豆豉是利用細(xì)菌等多種微生物發(fā)酵而成的食品[3]，其微生物主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、乳酸菌(Lactobacillus)和微球菌(Micrococcus)[4-6]。因豉香誘人，同時(shí)具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7]，以及抗氧化、降血糖、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、溶栓、防癌等生理功效[8-12]，因此，水豆豉逐漸受到消費(fèi)者的喜愛，并引起了科研人員的興趣[13]。

但是由于水豆豉的生產(chǎn)方式至今仍較落后，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致其生產(chǎn)品質(zhì)不穩(wěn)定，隨著食用人群的增多，隨之出現(xiàn)的豆豉安全性問(wèn)題也逐漸增多，備受消費(fèi)者與研究人員的關(guān)注[14]，目前關(guān)于自然發(fā)酵型水豆豉的細(xì)菌菌群動(dòng)態(tài)變化的研究鮮有報(bào)道。

研究應(yīng)用DGGE-PCR技術(shù)對(duì)貴州某工廠生產(chǎn)的自然發(fā)酵型水豆豉進(jìn)行細(xì)菌菌群的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)研究，這對(duì)掌握自然發(fā)酵型水豆豉生產(chǎn)過(guò)程中食源性致病菌的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)估其生物安全性以及指導(dǎo)生產(chǎn)控制具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、95%乙醇、鹽酸：重慶川東化工有限公司；檸檬酸氫二銨([(NH4)2HC6H5O7])：湖北興銀河化工有限公司；結(jié)晶紫：湖北大學(xué)化工廠；Na2EDTA·2H2O(ethylene diamine tetraacetic acid)、丙烯酰胺(acrylamide)、去離子甲酰胺(formamide deionized)、TEMED(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine)：AMRESCO公司。

自然發(fā)酵豆豉樣本：采集自貴陽(yáng)某工廠曲房，制曲期間每隔6 h采集一次，采集3 d。后發(fā)酵每隔1 d采樣一次，采集7 d。

E.coliBL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；測(cè)序載體pGEM-T Easy Vector System I購(gòu)自Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái) 上海錦星科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-GENIE2漩渦混合器 基因有限公司；XSZ-G生物顯微鏡 泰克儀器有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋 英國(guó)阿斯太歐(Astell)公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System、C1000 TouchTMThermal Cycler、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀 Bio-Rad公司；Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀 AB公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵接種

剛蒸煮的黃豆，帶上手套不停翻涼至40 ℃后，做好標(biāo)記，放置于曲房。

1.3.2 宏基因組的提取

豆豉樣本宏基因組DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取基因組。樣品預(yù)處理過(guò)程：取5 g豆豉于45 mL無(wú)菌PBS(pH 7.2)緩沖液中，120 r/min，30 min；吸取1 mL菌懸液，500 r/min，離心10 min。室溫靜置30 min，管底有沉淀；移上清液至新EP管中，12000 r/min，離心5 min，棄上清得沉淀；分別吸取500 μL滅菌生理鹽水，重懸菌體之后再補(bǔ)500 μL無(wú)菌PBS緩沖液，顛倒混勻，12000 r/min，5 min，重復(fù)2次。沉淀再用無(wú)菌TE緩沖液(pH 8.0)重懸菌體2次，將沉淀移置于另一EP管中。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

選取幾對(duì)細(xì)菌通用引物登錄NCBI進(jìn)行比對(duì)，所用引物見表1。

表1 細(xì)菌PCR引物Table 1 The bacterial PCR primers

注：GC clamp*序列-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

采用降落式PCR(Touchdown PCR)，其反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Primer F with GC 1 μL、Primer R 1 μL、Template 1 μL、Taq 0.25 μL、UPW 37.25 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；68 ℃(每降0.5 ℃ 1個(gè)循環(huán)) 30 s；72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)；58 ℃ 30 s；20個(gè)循環(huán)，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃，∞。

1.3.4 DGGE凝膠電泳及圖譜分析

參照Muyzer等[15]的方法，對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。電泳結(jié)束后用 Quantity One(Bio-Rad)進(jìn)行條帶數(shù)、多樣性及粗定量分析。

1.3.5 DGGE切膠回收及克隆測(cè)序

切取目的片段，加ddH2O，于4 ℃ 過(guò)夜保存。取1 μL上清液作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Omego試劑盒回收純化，與載體連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定，取陽(yáng)性質(zhì)粒送至寶生物工程(大連)有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組的提取

圖1 制曲期間自然發(fā)酵豆豉基因組圖Fig.1 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL15000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖2 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵基因組圖Fig.2 Genetic diagram of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL15000 DNA marker; 泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7 d。

由圖1和圖2可知，自然發(fā)酵制曲和后發(fā)酵期間，條帶都較為完整，片段大小至少大于15000 bp，可進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增?；蚪M提取，片段明亮且較為完整，片段大小至少大于15000 bp，適應(yīng)于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和PCR擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因組27F-1492R

圖3 制曲期間自然發(fā)酵水豆豉27F-1492R擴(kuò)增Fig.3 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker; 泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖4 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵水豆豉27F-1492R擴(kuò)增Fig.4 27F-1492R PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為1,2,3,4,5,6,7 d。

由圖3和圖4可知，自然發(fā)酵型水豆豉用16S rDNA基因組引物27F-1492R擴(kuò)增出目的條帶，大小為1465 bp，條帶單一，滿足后續(xù)細(xì)菌V3區(qū)擴(kuò)增試驗(yàn)對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求。

2.3 PCR擴(kuò)增細(xì)菌V3區(qū)

圖5 制曲期間自然發(fā)酵豆豉細(xì)菌V3區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.5 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during koji making

注：泳道M表示DL2000 DNA marker;泳道1～12表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為 0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h。

圖6 后發(fā)酵期間自然發(fā)酵豆豉細(xì)菌V3區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.6 V3 PCR amplification of naturally fermented soya beans during post fermentation

注：泳道M表示DL2000 DNA marker；泳道1～7表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為1,2,3,4,5,6,7 d。

由圖5和圖6可知，以總DNA產(chǎn)物為模板，采用降落式PCR程序進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)的擴(kuò)增，所有樣品均擴(kuò)增出堿基長(zhǎng)度約為250 bp，目標(biāo)條帶單一，滿足后續(xù)DGGE試驗(yàn)對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求。

2.4 自然發(fā)酵型水豆豉不同階段DGGE結(jié)果

自然發(fā)酵型水豆豉不同階段DGGE結(jié)果見圖7。

圖7 自然發(fā)酵水豆豉DGGE結(jié)果Fig.7 The DGGE result of naturally fermented soya beans

注：條帶CK表示未發(fā)酵樣品；條帶1～11表示水豆豉發(fā)酵時(shí)間分別為6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，66 h;條帶12～18表示水豆豉后發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7 d。

制曲期間發(fā)酵6～48 h、后發(fā)酵54 h～7 d鑒定結(jié)果見表2。

表2 制曲期間發(fā)酵6～48 h、后發(fā)酵54 h～7 d鑒定結(jié)果Table 2 The identification results of fermenting for 6～48 h during koji making and 54 h～7 d during post fermentation

續(xù) 表

不同發(fā)酵時(shí)間條帶數(shù)統(tǒng)計(jì)見圖8。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間條帶數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.8 The bands statistics of different fermentation time

PCR-DGGE技術(shù)分離出16種微生物(見圖9)，其中豆子樣本(CK)中，Serratiamarcescens、枯草芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、Alcaligenesfaecalis是豆豉未發(fā)酵，剛放進(jìn)曲房存在的微生物。嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)以及熱噬淀粉芽孢桿菌的存在是因?yàn)槎刽l(fā)酵環(huán)境中，曲溫達(dá)到 50 ℃左右，適宜嗜熱細(xì)菌的生長(zhǎng)，而其他一些不適宜高溫的微生物則被抑制。其中，人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)僅出現(xiàn)在發(fā)酵42～48 h。

自然發(fā)酵制曲后期及后發(fā)酵時(shí)期，特有的微生物有索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)、地衣芽孢桿菌。叢毛單胞菌屬(Comamonasjiangduensis)只存在后發(fā)酵5～6 d。

圖9 自然發(fā)酵水豆豉CK～48 h、54 h～7 d細(xì)菌分布Fig.9 The bacterial distribution of naturally fermented soya beans at CK～48 h, 54 h～7d

3 討論

通過(guò)PCR-DGGE鑒定，枯草芽孢桿菌自然發(fā)酵豆豉在制曲階段的18條條帶中，有12條屬于枯草芽孢桿菌屬，后發(fā)酵階段的19條條帶中，有11條屬于枯草芽孢桿菌屬，證實(shí)了枯草芽孢桿菌的數(shù)量及種類具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為主酵微生物?？莶菅挎邨U菌屬中，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)以及熱噬淀粉芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)貫穿整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，且從條帶亮度判斷，大量存在。

在貴州自然發(fā)酵型水豆豉過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了(條件)致病菌，如奇異變形桿菌，這在國(guó)內(nèi)外豆豉微生物分離鑒定的報(bào)道中，第一次在貴州自然發(fā)酵型水豆豉中分離得到，其中還包括蠟樣芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，存在于豆豉后發(fā)酵1～7 d期間。蠟樣芽孢桿菌是常見的食品污染菌和條件致病菌，污染的食物主要為含淀粉較多的各類食物[16]，同時(shí)還檢測(cè)到糞腸球菌(Enterococcusfaecium)，其具有較強(qiáng)的產(chǎn)酪胺和苯乙胺能力[17]，變形桿菌屬可產(chǎn)組胺，球腸菌屬可產(chǎn)酪胺，沙雷氏菌屬可產(chǎn)腐胺。推測(cè)豆豉發(fā)酵過(guò)程中，芽孢桿菌屬、奇異變形桿菌、居泉沙雷菌以及屎腸球菌與貴州水豆豉生物胺產(chǎn)生息息相關(guān)。

糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)可以抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)等微生物，通常對(duì)人體無(wú)害，可致病，引起腸炎、尿路感染，大多不嚴(yán)重。研究分離出來(lái)的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、納豆芽孢桿菌(B.natto)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)是目前可利用于生物防治領(lǐng)域的菌株，在貴州自然發(fā)酵型水豆豉中上述菌株為主要發(fā)酵菌株。

以上說(shuō)明自然發(fā)酵型水豆豉目前存在潛在的食品安全問(wèn)題，分析可以通過(guò)添加輔料、控制發(fā)酵條件或控制生產(chǎn)環(huán)境來(lái)抑制甚至殺死原料中本身帶有的致病菌或條件致病菌，本研究對(duì)貴州自然發(fā)酵型水豆豉的分析以及對(duì)其致病菌的防控具有重要意義。同時(shí)，枯草芽孢桿菌屬與其他菌屬是否具有拮抗作用的研究，從細(xì)菌菌群演變情況監(jiān)測(cè)水豆豉生物胺的含量，不同地區(qū)豆豉樣本的差異還可進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)在貴州傳統(tǒng)自然發(fā)酵型水豆豉中鑒定，枯草芽孢桿菌的數(shù)量及種類具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為主酵微生物。共有的種群包含枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)以及熱噬淀粉芽孢桿菌(Bacillusthermoamylovorans)。研究表明，貴州水豆豉中微生物多樣性較高，研究結(jié)果為探索特色水豆豉的安全標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)加工及其生物安全性提供了參考。