褚 鑫 安曉夏 嚴(yán)劍波 張紅梅

(山東省秦皇島市婦幼保健院1 功能科，2 超聲科，秦皇島市 066000，電子郵箱：chdejuan@126.com)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率也位居女性惡性腫瘤前列[1-2]，早期診斷疾病并判斷其病理特征有助于準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)疾病、制定治療方案。剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的超聲檢查手段，其在質(zhì)地硬的組織中傳播速度快，而在軟的組織中傳播速度慢，所以可以根據(jù)超聲波在不同彈性組織中傳播速度的差異來(lái)反映組織彈性。在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，病灶內(nèi)癌細(xì)胞的增殖和侵襲會(huì)引起局部組織硬度增加，因此，通過(guò)SWE來(lái)檢測(cè)病灶組織的硬度可以判斷病灶?lèi)盒蕴卣?，甲狀腺癌組織的SWE參數(shù)發(fā)生顯著變化并且與多種癌基因的表達(dá)相關(guān)[3]。為了明確SWE在乳腺癌病情評(píng)價(jià)中的作用價(jià)值，本研究分析乳腺癌SWE彈性模量與病灶內(nèi)增殖、侵襲基因蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2016年3月至2018年3月期間在我院接受手術(shù)切除的42例乳腺癌患者及30例乳腺良性腫瘤患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為乳腺癌或乳腺良性腫瘤；(2)術(shù)前均接受SWE檢查；(3)取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過(guò)放化療、靶向藥物治療者；(2)臨床資料不完整者。乳腺癌患者年齡43～64(53.31±7.62)歲，已絕經(jīng)17例；乳腺良性腫瘤患者年齡37～60(52.18±8.41)歲，已絕經(jīng)9例。乳腺癌患者和乳腺良性腫瘤患者一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 試劑與儀器 放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液(貨號(hào)：P0013)及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：P0012)購(gòu)自上海碧云天公司，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(貨號(hào)：SC-8396、SC-6246、SC-53906、SC-13595、SC-393859)，二抗購(gòu)自北京全式金公司(批號(hào)：HS201-01)。HD5型超聲診斷儀購(gòu)自飛利浦公司，Tanon4800型凝膠成像儀購(gòu)自上海天能公司。

1.3 SWE檢查方法 首先進(jìn)行常規(guī)超聲，記錄病灶的位置、大小、形態(tài)、邊界、血流等信息。隨后進(jìn)行SWE檢查，探頭頻率調(diào)至5～14 MHz、檢查區(qū)域調(diào)至病灶面積的2倍，靜置3～5 s后圖像穩(wěn)定并凍結(jié)，測(cè)定病灶的彈性模量值，每個(gè)病灶重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.4 增殖、侵襲基因蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 取患者手術(shù)切除的腫瘤組織，采用RIPA蛋白裂解液提取乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量后，取50 μg蛋白樣本與上樣緩沖液混合，加熱變性后加入聚丙烯酰胺凝膠的點(diǎn)樣槽內(nèi)，電泳、電轉(zhuǎn)膜后將蛋白樣本從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜放入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，用TBST溶液洗膜3次，5 min/次，加入1 ∶1 000稀釋的一抗CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、β-肌動(dòng)蛋白(內(nèi)參蛋白)，4℃孵育過(guò)夜；用TBST溶液洗膜3次，5 min/次，加入1 ∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。在凝膠成像儀中曝光硝酸纖維素膜，觀察蛋白條帶，采用Image J軟件掃描條帶灰度值，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值為目的蛋白的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織SWE圖像與彈性模量值的比較 乳腺癌和乳腺良性腫瘤的SWE圖像見(jiàn)圖1，乳腺癌、乳腺良性腫瘤SWE的彈性模量值分別為(83.51±11.32)、(32.77±6.03)。乳腺癌的彈性模量值高于乳腺良性腫瘤(t=22.360，P<0.001)。

乳腺癌 乳腺良性腫瘤

圖1 乳腺癌和乳腺良性腫瘤的SWE圖像

2.2 不同病理特征患者乳腺癌組織SWE參數(shù)的比較 不同腫瘤象限、病理分型患者的乳腺癌組織彈性模量值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤直徑T3者的彈性模量值高于T1～2者，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的彈性模量值高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，臨床分期Ⅲ期者的彈性模量值高于Ⅰ～Ⅱ期者(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同病理特征患者乳腺癌SWE參數(shù)彈性模量值的比較(x±s)

2.3 乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織中增殖侵襲基因蛋白表達(dá)水平的比較 乳腺癌組織CyclinD1、MMP-2、MMP-9的相對(duì)表達(dá)水平高于乳腺良性腫瘤組織；p21的相對(duì)表達(dá)水平低于乳腺良性腫瘤(均P<0.05)；兩種組織p27的相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 乳腺癌組織SWE參數(shù)與增殖侵襲基因表達(dá)水平的相關(guān)性 選擇2.3中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增殖侵襲基因CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平與乳腺癌組織SWE彈性模量值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示乳腺癌組織SWE彈性模量值與CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，與p21蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 乳腺癌和乳腺良性腫瘤組織CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較(x±s)

表3 乳腺癌組織SWE彈性模量值與增殖侵襲基因蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

多普勒超聲是臨床上篩查乳腺腫瘤、甲狀腺腫瘤的常用手段，具有無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)獲取腫瘤的形態(tài)、邊界、血供、鈣化等信息評(píng)估腫瘤的性質(zhì)。SWE的原理是通過(guò)超聲探頭發(fā)生聲輻射力并在組織中形成橫向傳播的剪切波，剪切波在不同彈性的組織中傳播速度存在顯著差異[4-5]，可通過(guò)SWE參數(shù)彈性模量值的測(cè)定評(píng)估病灶組織的彈性，從而判斷病灶性質(zhì)[6-7]。

有研究顯示，SWE對(duì)甲狀腺癌及乳腺癌具有一定的診斷價(jià)值[8-9]；唐智勇等[10]的研究則證實(shí)SWE對(duì)乳腺癌化療的效果具有一定的評(píng)估價(jià)值。乳腺癌病灶彈性的改變與病灶內(nèi)癌細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)密切相關(guān)，癌細(xì)胞自身的增殖會(huì)使局部組織的硬度增加，而癌細(xì)胞的浸潤(rùn)則會(huì)使周?chē)M織受牽拉并引起硬度增加[9]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織的彈性模量值高于乳腺良性腫瘤組織(P<0.05)，提示乳腺癌病灶組織的彈性明顯下降、硬度明顯增加，SWE對(duì)乳腺癌具有一定的評(píng)估價(jià)值。腫瘤的部位、大小、分型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征被用于反映乳腺癌病灶的增殖和浸潤(rùn)情況，本研究結(jié)果顯示，病灶直徑越大、臨床分期越高及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者SWE彈性模量值增加，這提示彈性模量值與乳腺癌病理特征密切關(guān)系，因此通過(guò)SWE檢查或可以對(duì)病理特征進(jìn)行評(píng)估。

目前已知與乳腺癌病灶內(nèi)癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)相關(guān)的基因有CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9等。CyclinD1、p21、p27參與細(xì)胞周期調(diào)控，CyclinD1與相應(yīng)激酶結(jié)合后能夠縮短細(xì)胞周期時(shí)限、加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化并使大量細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂階段、促進(jìn)細(xì)胞增殖[11-12]；p21、p27能夠拮抗CyclinD1與激酶的結(jié)合并阻礙細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂階段、抑制細(xì)胞增殖[13]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中的明膠酶，在腫瘤病灶內(nèi)能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中的多種蛋白成分，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)病灶、向鄰近及遠(yuǎn)處浸潤(rùn)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織p27蛋白表達(dá)水平與乳腺良性腫瘤差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平高于乳腺良性腫瘤，且與彈性模量值呈正相關(guān)，p21蛋白表達(dá)水平低于乳腺良性腫瘤，且與彈性模量值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。這提示乳腺癌組織的彈性與增殖、侵襲基因表達(dá)水平有關(guān)，推測(cè)增殖、侵襲基因蛋白表達(dá)的變化可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌硬度增加，而通過(guò)SWE檢查可以評(píng)估癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)情況。

綜上所述，乳腺癌組織SWE參數(shù)彈性模量值較良性腫瘤組織增加，并且與腫瘤病理特征改變、增殖和侵襲基因表達(dá)異常有關(guān)。