改良QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定植物油中香蘭素·甲基香蘭素和乙基香蘭

劉強(qiáng)欣　張虹　胡云強(qiáng)　聞佳鈺　陳瑜　吳丹虹　何曉明

摘要 [目的]建立植物油中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。[方法]以QuEChERS為基礎(chǔ)，樣品經(jīng)乙腈-水（80∶20，V/V）提取，采用EMR-Lipid凈化，以ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離后，在電噴霧離子源的負(fù)離子模式下，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù)，外標(biāo)法分量。[結(jié)果]在10～1 000 μg/L香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素這3種化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.993～0.998。[結(jié)論]該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、快速，適用于植物油中3種香精的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 QuEChERS;香蘭素;甲基香蘭素;乙基香蘭素;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;植物油

中圖分類號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）11-0198-04

Abstract [Objective]A liquid chromatographytandem mass spectrometric（LC-MS/MS）method was developed for the simultaneous determination of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in vegetable oils.[Method]The sample was extracted with acetonitrile-water（80∶20，V/V），cleared up by EMRLipid.The separation of target compounds were performed on an ACQUITY UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）.Then the sample were ionized using Electrospray ionization （ESI），examined under multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.[Result]The linear ranges of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin were 10-1 000 μg/L，with correlation coefficients（r） of 0.993-0.998.[Conclusion]It is simply，accurate，sensitive and quick for the detection of three essnces in vegetable oils.

Key words QuEChERS;Vanillin;Methyl vanillin;Ethyl vanillin;High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry;Vegetable oils

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素是食品中常見的食用香料，其中香蘭素是天然存在于咖啡、蘆筍和香蘭莢中，后兩者是人工合成的化合物。它們是一種允許添加的食品添加劑，在糖果、餅干、糕點(diǎn)和飲料中被廣泛應(yīng)用。但有相關(guān)文獻(xiàn)表明過(guò)量食入香精可導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至?xí)p傷肝腎[1]。植物油是由不飽和脂肪酸和甘油化合而成的化合物，廣泛分布于自然界中，是從植物的果實(shí)、種子、胚芽中得到的油脂（如菜籽油、大豆油和花生油等）。我國(guó)是植物油消費(fèi)大國(guó)，植物油是一種生活必需品，人們每天通過(guò)各種形式攝入植物油，隨著我國(guó)改革開放和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平日漸提升，食品產(chǎn)品安全意識(shí)逐步提高，并且依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定植物油脂是不得添加食用香料、香精，因此植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢測(cè)就很有意義了。

目前，對(duì)于香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測(cè)定方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-7]等。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確、高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，在食品分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)采用改進(jìn)Quick Easy Cheap Effective Rugged（QuEChERS）方法凈化，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑。樣品為市售植物油。甲酸、乙腈和甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo公司）; 增強(qiáng)型基質(zhì)去除吸附劑（EMR-Lipid，美國(guó)Agilent公司）;十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）（天津博納艾杰爾科技有限公司）;試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。香蘭素（含量98.8%），美國(guó)CATO公司; 甲基香蘭素（含量98.3%），上海ANPEL公司;乙基香蘭素（含量99.9%），上海ANPEL公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備。三重四級(jí)桿液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS 8050，日本Shimadzu公司）;多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）;高速冷凍離心機(jī)（ST16R，美國(guó)Thermo公司）;超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）;超聲波清洗器（KQ-500E，500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

用甲醇分別配制香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的10 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-18 ℃ 下避光保存。用時(shí)根據(jù)需要用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理。

稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈溶液渦旋混勻，超聲提取10 min， 8 000 r/min離心 3 min，移取4 mL上清液置于0.5 g EMR-Lipid 凈化管中（使用前用2 mL水充分潤(rùn)濕活化），渦旋振蕩2 min，8 000 r/min 離心3 min，轉(zhuǎn)移凈化液至已提前加入0.5 g氯化鈉和1.0 g無(wú)水硫酸鈉的10 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min 離心3 min，將凈化液移入10 mL離心管中，40 ℃下氮吹至干，加入1.0 mL 初始流動(dòng)相渦旋溶解殘留物，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3 色譜條件。

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;進(jìn)樣量3 μL;柱溫35 ℃;流動(dòng)相為0.1%氨水溶液（A）和甲醇（B）;流速為0.3 mL/min;流動(dòng)相梯度程序見表 1。

1.2.4 質(zhì)譜條件。

電噴霧離子源（ESI），溫度400 ?℃，毛細(xì)管電壓3 000 V;掃描方式：負(fù)離子模式;霧化氣流量：3.0 L/min;加熱氣流量：10.0 L/min;定性與定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見表 2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式上同時(shí)具有羥基和醛基，因此分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)濃度為1.0 mg/L化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描。結(jié)果表明，3種化合物均能產(chǎn)生[M+H]+以及[M-H]-的準(zhǔn)分子離子，但在負(fù)離子模式能夠提供更多的碎片信息。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，并根據(jù)EU第657/2002/EC號(hào)決議中有關(guān)規(guī)定中有關(guān)質(zhì)譜分析方法必須不少于4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的規(guī)定，選擇2對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)最佳的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相應(yīng)參數(shù)作為最終質(zhì)譜采集參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用負(fù)離子模式分析樣品時(shí)，在流動(dòng)相中加入適量的堿性物質(zhì)可提高化合物的離子化效率。該試驗(yàn)考察了甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水這2種流動(dòng)相體系在相同梯度洗脫條件下對(duì)3種化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-0.1%氨水作為流動(dòng)相，化合物具有更好的分離效果和響應(yīng)值， 3種化合物總離子流色譜圖見圖1。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化。

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素均屬于弱極性化合物，甲醇、乙腈是常用的提取溶劑。該試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈2種提取溶劑對(duì)化合物提取效率的影響。結(jié)果表明，乙腈的提取效率較好，且提取液帶出的油脂雜質(zhì)較少[8-12]，提取液顏色更清澈，便于后續(xù)凈化。

由于植物油樣品與乙腈互溶性不佳，直接用乙腈提取存在分散不夠完全的現(xiàn)象。為改善提取效果，在提取時(shí)加入一定量水，不但可以分散樣品，又提高了乙腈對(duì)于樣品的滲透性，從而改善提取效率[13]。該試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%乙腈溶液和純乙腈5種提取試劑進(jìn)行了比較。結(jié)果表明（圖2），當(dāng)提取溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取效率最高。因此選擇80%乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取時(shí)間的優(yōu)化。

比較不同的超聲時(shí)間（5、10、20、30 min）對(duì)3種化合物提取效率的影響，結(jié)果顯示（圖3），在超聲提取10 min時(shí)可獲得較好的回收率，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，提取效率無(wú)明顯差異。因此選擇超聲10 min提取樣品。

2.3.3 吸附劑的優(yōu)化。

植物油中主要的基質(zhì)干擾為脂類物質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在會(huì)干擾化合物的測(cè)定，影響方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。因此選擇合適的吸附劑來(lái)去除雜質(zhì)以降低基質(zhì)效應(yīng)（ME）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，成為QuEChERS方法的關(guān)鍵。該試驗(yàn)為考察C18、PSA和EMR-Lipid這3種吸附劑的凈化效果，分別將QuEChERS方法中常規(guī)用量0.5 g C18、PSA和EMR-Lipid凈化劑分別加入到4 mL加標(biāo)濃度為50 μg/kg的植物油提取液中，以ME值評(píng)價(jià)3種吸附劑的凈化效果，ME=（基質(zhì)加標(biāo)溶液響應(yīng)值/空白溶劑中加標(biāo)溶液響應(yīng)值）×100%。

結(jié)果表明，EMR-Lipid凈化效果優(yōu)于C18、PSA（圖4）。這可能是與傳統(tǒng)吸附劑C18、PSA相比，特殊聚合物基質(zhì)EMR-Lipid是一種針對(duì)油脂類成分設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑，能夠?qū)ｉT吸附長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)脂類物質(zhì)，選擇吸附性好，能有效降低高脂肪含量基質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分的干擾。

為確定EMR-Lipid的合適用量，該試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 g EMR-Lipid的凈化效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，當(dāng)EMR-Lipid用量為0.50 g時(shí)，化合物回收率均大于80%，繼續(xù)增加EMR-Lipid用量，其回收率之間沒(méi)有顯著差異。因此最終選擇0.5 g EMR-Lipid作為吸附劑的合適用量。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限。

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。配制系列濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以化合物的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明（表3），在10～1 000 μg/L 3種化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.993～0.998。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比確定樣品檢出限（LOD），10倍信噪比確定方法定量限（LOQ），得到3 種化合物的檢出限為9.2～11.4 μg/kg，定量限為30.4～37.6 μg/kg。

2.4.2 回收率與精密度。為考察該試驗(yàn)的可行性，向空白菜籽油、大豆油和花生油樣品中添加高、中、低3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組做6個(gè)平行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下不同油品的平均回收率在72.8%～91.8%，RSD為1.6%～8.6%，準(zhǔn)確度與精密度能滿足實(shí)際分析的要求。

2.5 與國(guó)標(biāo)方法的比較

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素這3種化合物現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法為BJS 201705《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測(cè)定》，該國(guó)標(biāo)方法中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素檢出限均為30.0 μg/kg，定量限均為100.0 μg/kg。該方法檢測(cè)香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢出限明顯低于上述國(guó)標(biāo)方法。同時(shí)在樣品前處理上，相對(duì)于國(guó)標(biāo)方法，該方法對(duì)于提取溶劑、提取時(shí)間、吸附劑進(jìn)行了優(yōu)化，并且操作簡(jiǎn)方便、回收率高。

3 結(jié)論

該研究建立了植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法方法，通過(guò)改良QuEChERS方法，使得香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素在植物油中的提取效率、靈敏度均顯著提高，優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、快速，可滿足植物油中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的快速測(cè)定要求。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊華梅，杭莉.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中4種常用香精[J].色譜，2015，33（3）：250-255.

[2] 馮彩婷，楊麗霞，李書靜.紫外-可見分光光度法測(cè)定奶粉中的香蘭素含量[J].河北化工，2012，35（6）：78-80.

[3] 劉祥萍，黃薇.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中的甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，40（4）：296-297.

[4] 羅冠中，劉祥，孟云彩.液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方食品中甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].分析試驗(yàn)室，2011，30（8）：84-87.

[5] 曲寶成，戴學(xué)東，張敬波，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物油中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（4）：935-941.

[6] 周靜，彭亞鋒，胡守江.同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰兒配方乳粉中的4種香料[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（14）：3643-3649.

[7] 趙建國(guó)，姜金斗.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定嬰幼兒奶粉中香蘭素和乙基香蘭素[J].生命科學(xué)儀器，2013，11（5）：40-44.

[8] 蘇建峰，林谷園，連文浩，等.兩種水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留分析的樣品前處理方法及其在111種農(nóng)藥和相關(guān)化學(xué)品殘留同時(shí)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].色譜，2008，26（3）：292-300.

[9] 李曉婷，王紀(jì)華，朱大洲，等.果蔬農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27（S2）：363-370.

[10] 黎其萬(wàn)，劉宏程.測(cè)定植物油中甲萘威和克百威農(nóng)藥殘留的高效液相色譜法[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（8）：91-92.

[11] 程景，李培武，張文，等.基質(zhì)固相分散-氣相色譜法測(cè)定植物油中多種擬除蟲菊酯類及有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2008，30（3）：346-352.

[12] 賈瑋，凌云，郝靜，等.在線凝膠滲透色譜串聯(lián)氣相色譜-質(zhì)譜快速測(cè)定糧谷及油料作物中29種農(nóng)藥殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31（10）：1217-1222.

[13] 徐娟，王嵐，黃華軍，等.低溫冷凍及分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物油中104種農(nóng)藥殘留[J].色譜，2015，33（3）：242-249.