郎潔, 孫強, 張超

近年來,乳腺癌的發(fā)病率逐年上升,已成為我國及全世界最常見的嚴重影響女性身心健康的惡性腫瘤之一,居我國女性惡性腫瘤首位[1]。乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中,受到多種基因、蛋白的調控[2-3],是一個復雜的,涉及腫瘤與宿主間相互作用的多步驟的過程[4]。近年來的研究顯示,SATB2為組織特異性表達的核基質序列特異性結合蛋白,與腫瘤的侵襲轉移密切相關,但SATB2在乳腺癌中的表達水平及對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響尚未見報道[5]?；诖?本研究選擇北京市隆福醫(yī)院收治的80例乳腺癌患者為研究對象,從分子、蛋白水平觀察SATB2在乳腺癌中的表達情況,觀察轉染SATB2基因對乳腺癌細胞生物學特性的影響,結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇本院2017年1月至2018年6月收治的80例乳腺癌患者為研究對象,均為女性,年齡30～60歲,平均年齡(45.17±6.84)歲;TNM分期:0期14例,Ⅰ期38例,Ⅱa期17例,Ⅱb期11例;病理類型:導管原位癌7例,浸潤性導管癌42例,浸潤性小葉癌17例,黏液癌10例,乳頭狀癌4例。所有患者均對研究知情同意,自愿簽署知情同意書。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。收集80例新鮮乳腺癌組織及對應的癌旁組織臨床樣本,手術切除后立即投入液氮保存。分別取部分新鮮組織分離組織蛋白、制作免疫組化切片。

1.2 主要試劑與儀器 詳見表1。

表1 主要試劑與儀器

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化 ①固定、脫水、包埋。取組織放入4%多聚甲醛里面固定3～4 h,取適當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。打開包埋機,將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,進行包埋。②切片、制片。打開切片機,固定蠟塊,用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片,制片。③組織化學染色。60 ℃干烤2 h脫蠟,二甲苯、梯度酒精、PBS沖洗凈殘余石蠟。以檸檬酸鈉,微波抗原修復,溫度控制在96 ℃～98 ℃。然后將切片放入熱鍋中15 min,最后自然冷卻室溫。以免疫組化筆圈圍住組織,并將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%H2O2溶液室溫孵育10 min。甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液,放入濕盒內,室溫10 min。滴加一抗蓋住組織,濃度為1∶200,然后放入濕盒內4 ℃過夜。第二天,4 ℃冰箱取出濕盒,室溫復溫30 min,PBS沖洗,甩干水分,滴加二抗,室溫孵育10 min。每張片子滴加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗凈后,100 μl DAB溶液,顯微鏡下觀察3～10 min。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。蘇木素復染,1～2 min,細胞核變藍色即可終止,0.5%氨水反藍,1%鹽酸酒精分化3 s,自來水沖洗3 min。梯度酒精脫水,晾干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,封片,顯微鏡下拍照保存。

1.3.2 組織標本總RNA提取 取100 mg乳腺癌、癌旁組織置于研缽中,加入少量液氮后快速研磨。研磨充分后,加入2 ml Trizol試劑,混勻并轉移至離心管。電動勻漿2 min后,以12 000 g/min離心5 min,棄沉淀,轉移上清。加入1/5體積的氯仿,振蕩混勻,室溫靜置15 min后,以12 000 g/min 4 ℃離心15 min。轉移水相至新離心管,加入1/2體積異丙醇,混勻后,室溫靜置10 min。12 000g/min 4 ℃離心10 min。棄上清,加入等體積的75%乙醇,溶解沉淀。9 000 g/min離心5 min,棄上清,室溫干燥,加入50 μl DEPC處理的無菌H2O溶解RNA樣品。

1.3.3 逆轉錄合成cDNA 采用Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒,按表2比例配置反轉錄反應液,將RNA及反應液于37 ℃反應15 min,98 ℃酶失活5 min。結束反應,產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)銻eal-time PCR使用。

表2 逆轉錄反應液(10 μl體系)

1.3.4 Real-time PCR 采用PowerUpTMSYBRTMGreen試劑盒,引物序列見表3。反應體系見表4。以熒光定量PCR儀進行擴增,擴增程序如下:95 ℃ 10 s×1次;(95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s)×40次。以β-actinCt值標準化目的基因Ct值,2△t法計算樣品擴增倍數(shù)。

表3 PCR引物序列

表4 Real-time反應體系(50 μl)

1.3.5 Western-blot 以研磨法勻漿乳腺癌組織,加400 μl單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織,置于冰上操作。裂解30 min后,將裂解液轉移至1.5 ml EP管中,4 ℃ 12 000 rpm/min離心5 min,取上清分裝于0.5 ml離心管,-20 ℃保存。以BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液,水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓80 v,溴酚藍進入分離膠后調整電壓為120 v繼續(xù)電泳,至溴酚藍遷移至分離膠底部,終止電泳。以4 ℃,300 mA恒流,70 min,將蛋白轉移至PVDF轉膜上,麗春紅染色觀察轉膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h,洗滌后,滴加兔抗SATB2溶液,4 ℃過夜孵育。第二天加入TBST洗滌去除多余一抗,與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后,加入ECL化學發(fā)光底物,在化學發(fā)光儀上顯影,拍照保存。

1.3.6 CCK8檢測增殖 pGV141-SATB2質粒構建參考文獻報道[6]。將處于對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7,以胰酶消化后,用DMEM培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×105個/ml,每孔100 μl接種至96孔板。將細胞分為3組,1組pGV141空載組,1組pGV141-SATB2組,未加質粒的空白對照組。每組在培養(yǎng)的0 h,24 h、48 h加入CCK8溶液,每孔20 μl,4 h后終止培養(yǎng)。以酶標儀在450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.3.7 Transwell試驗檢測遷移、侵襲能力遷移試驗

以0.2%BSA的無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液,細胞數(shù)為5×105個/ml,取200 μl鋪于8 μm transwell小室上層,加500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于24孔板底部,培養(yǎng)24 h后取走Transwell板,計數(shù)穿孔細胞數(shù)。侵襲試驗:將300 μl無血清DMEM培養(yǎng)基加入8 μm Transwell小室上層,室溫下水化基質膠20 min,棄去剩余液體。以0.2%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基配制濃度5×105個/ml的單細胞懸液,其余步驟同遷移試驗。

60年來，鹽湖股份秉承“為用戶提供綠色鎂鋰鉀”的愿景目標，以“深化改革、提升管理、做專做精、持續(xù)發(fā)展”16字為指導方針，按照“走出鉀、抓住鎂、發(fā)展鋰、整合堿”的戰(zhàn)略布局，體現(xiàn)“循環(huán)利用，產(chǎn)業(yè)報國”鹽湖人的使命和擔當精神，不斷改革創(chuàng)新。5年來，四川鹽湖化工堅定不移地執(zhí)行鹽湖股份的戰(zhàn)略決策，崇尚“勤奮、謙虛、奉獻、責任、干凈、擔當”的企業(yè)文化，不斷完善營銷網(wǎng)絡，在國際國內市場上塑造了良好的“鹽花”品牌形象。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,計數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SATB2在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況

Real-time PCR檢測結果顯示,乳腺癌組織中SATB2 mRNA水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western-blot檢測結果顯示,乳腺癌組織中SATB2蛋白表達水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 Real-time PCR檢測乳腺癌及癌旁組織SATB2表達情況

圖2 Western-blot檢測乳腺癌及癌旁組織中SATB2表達情況

2.2 SATB2免疫組化結果

80例乳腺癌組織中,65例呈陽性表達(81.25%),15例呈陰性表達。80例癌旁組織中,20例呈陽性表達(25.00%),60例呈陰性表達。乳腺癌組織中SATB2陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 乳腺癌組織中3ATB2免疫組化陽性例數(shù)比較

圖4 乳腺癌組織(4A)及癌旁組織(4B)中SATB2表達情況(STAB法×400)

2.3 MCF-7細胞中SATB2轉染效率

圖5 Real-time PCR檢測SATB2轉染效率

2.4 MCF-7細胞轉染SATB2后細胞增殖的影響

在MCF-7細胞中,轉染pGV141-SATB2組細胞增殖率高于空白對照組及空載組(P<0.05)。見圖6。

2.5 MCF-7細胞轉染SATB2后遷移、侵襲的影響

MCF-7細胞中,轉染pGV141-SATB2后遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)均多于轉染pGV141及空白對照組(P<0.05)。見圖7。

圖6 MCF-7細胞中轉染SATB2對細胞增殖的影響

圖7 MCF-7細胞中轉染SATB2對細胞遷移(7A)、侵襲(7B)的影響

3 討論

乳腺癌為世界范圍內常見的惡性腫瘤,我國每年女性乳腺癌發(fā)病16.9萬人[7],為女性第二位最常見的惡性腫瘤。乳腺癌的發(fā)生與環(huán)境、遺傳、生活方式等密切相關[8-9],在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中,受到多種相關基因的調控。SATB2基因位于人類2號染色體2q33區(qū),編碼SATB2蛋白,為核基質結合區(qū)結合蛋白,可通過影響染色質結構[10],實現(xiàn)對目標基因表達的特異性調控,從而調節(jié)細胞分化、凋亡、腫瘤生長及轉移等[11]。在牙周疾病、骨髓疾病、腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[12]。Zhang等[13]的報道顯示,特殊富含AT序列結合蛋白SATB2在顱面部發(fā)育、成骨細胞分化中起關鍵作用,可與核基質結合區(qū)結合,并以MAR依賴的方式激活多種基因轉錄過程,直接或間接調控主要的骨基因表達。SATB2的表達與非小細胞肺癌增殖、轉移相關[14]。在乳腺癌組織中表達水平降低,SATB2的表達水平與臨床分期、組織分化呈負相關;與患者總生存率和無疾病生存期呈正相關。多因素分析提示SATB2的表達水平可以作為獨立的預后分析因素[15]。

SATB2基因被證實在多種腫瘤組織中高表達[16-17],表達水平與腫瘤惡性程度密切相關,但在乳腺癌中表達的報道尚不多見。本研究結果顯示,乳腺癌組織中SATB2陽性表達率高于癌旁組織,提示SATB2與乳腺癌的發(fā)生關系密切。通過Western-blot、PCR等方法觀察乳腺癌組織與癌旁組織中SATB2的相對表達量的結果顯示,SATB2在乳腺癌中的表達量高于癌旁組織,也證實了免疫組化的結果,這與Xu等[18]的研究結論一致。

增殖、轉移為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要特征,抑制腫瘤細胞增殖對提高腫瘤患者預后意義重大。為進一步探討SATB2在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,筆者從乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為入手,觀察轉染SATB2基因后,上述生物學行為改變情況。通過構建了pGV141-SATB2質粒,以脂質體轉染技術,觀察轉染SATB2基因至MCF-7細胞后,對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學特性的影響。結果顯示,轉染SATB2基因后,乳腺癌細胞增殖率顯著增加,遷移、侵襲至下層細胞數(shù)顯著增多。說明轉染SATB2基因可促進MCF-7細胞增殖、遷移及侵襲,提示SATB2可能為原癌基因。腫瘤的侵襲、轉移是多步驟、多因素相互作用的復雜過程,涉及多種信號轉導通路、相關蛋白分子的異常表達及腫瘤血管形成等多個生物學過程[19]。誘導腫瘤血管生成為腫瘤生長、浸潤、發(fā)生轉移的重要前提,腫瘤細胞可通過調節(jié)細胞表面不同黏附分子的表達,降低細胞間黏附性,細胞外基質間粘附性增加,此即為腫瘤侵襲轉移的起始[20]。在乳腺癌細胞系MCF-7遷移、侵襲的結果表明,轉染SATB2基因后,MCF-7細胞遷移、侵襲能力均顯著增強,表現(xiàn)為通過Transwell小室的細胞數(shù)明顯增多。

綜上所述,本研究初步證實了SATB2基因在乳腺癌中表達量高于癌旁組織。在乳腺癌細胞系MCF-7中,轉染SATB2基因可促進MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲,但SATB2促進MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲的具體機制尚未闡明。下一步需篩選乳腺癌中高表達的信號轉導通路或離子通道、血管生成相關基因,觀察SATB2是否通過激活信號轉導通路或離子通道,促進血管生成,使得乳腺癌細胞MCF-7的增殖、遷移、侵襲能力增強。